蛋白质工程实验指导.docx

蛋白质工程实验指导高文臣主编自编教材内容简介蛋白质工程实验指导适用于生物技术专业和生物工程专业的本科生，实验内容包括质粒的制备与鉴定、PCR产物的提纯、重组DNA的转化、外源基因在宿主菌中的诱导表达、表达蛋白的电泳鉴定等。目录实验一：质粒的制备与鉴定实验二：PCR产物的提纯实验三：重组DNA的转化实验四：外源基因在宿主菌中的诱导表达实验五：表达蛋白的电泳鉴定实验一：质粒的制备与鉴定一、实验目的学习质粒的基本性质，掌握最常用的质粒提取的原理与方法，为基因工程提供载体原料。二、实验原理???? 质粒是存在于细菌细胞中独立于染色体外，能进行自主复制的共价、闭环双链DNA分子（covalently closed circular DNA, ccc DNA），但其复制和转录需利用宿主细胞编码的酶和蛋白质。天然质粒大小约1kb-200kb，基因工程中使用的质粒为在天然质粒基础上经人工改造而得，大小约2.7-10kb。碱裂解法提取质粒DNA：染色体DNA和质粒DNA均为共价闭环分子，但染色体DNA（109D）比质粒DNA（106～107D）大得多。当用碱处理DNA溶液时，染色体DNA发生变性呈长线状不易复性，而质粒DNA虽也变性，但在回到中性pH时即可立即恢复其天然构象。变性的长线状染色体DNA易与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。再通过乙醇沉淀即可分离到质粒DNA。　??碱裂解法提取质粒DNA，提取过程包括三个重要步骤：培养细胞使质粒大量扩增，收集和分裂细菌并除去蛋白质和染色体DNA，分离纯化质粒。???? 三、实验试剂LB液体培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl，用NaOH调pH到7.2，121℃灭菌20min备用。固体LB培养基则在LB液体培养基中添加1.5%～2%琼脂，灭菌后备用；???? 含质粒的大肠杆菌菌株：如pBSSK/DH5α、pET28/BL21；???? 氨苄青霉素：母液100mg/ml，工作浓度100ug/ml；???? ?? ????? 溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），10mmol/L EDTA；???? 溶液II：0.2 mol/L NaOH，1% SDS；??? 溶液III：3mol/L醋酸钾用醋酸调到pH 4.8；???? 酚/氯仿/异戊醇：V/V=25:24:1；???? NaAc：3mol/L，pH5.2；???? TE：10mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1mmol/L EDTA；??? 无水乙醇；???? 70%乙醇；???? RNaseA：10mg/ml。???????? 进口琼脂糖 (agarose)：质量分数为0.8%～1.5%；???? 10×TBE缓冲液：108g Tris，55g硼酸，40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至1L。电泳时工作浓度为?0.5×TBE缓冲液；???? 溴化乙锭(ethidium bromide,EB)：贮存浓度为0.5mg/ml，工作浓度为0.5mg/L；???? 6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖，10mmol/L EDTA(pH8.0)，4℃保存；???? λDNA/HindⅢ标准Marker。???四、实验仪器灭菌锅；冰箱；制冰机；旋涡混合仪；微量移液器；超净工作台；常温离心机；水浴锅；核酸电泳仪；紫外分光光度计。五、实验步骤1、菌种的培养：将含质粒的菌液接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基中，37℃培养12-24小时。用无菌牙签或接种针挑取单菌落接种到5ml含100ug/ml Amp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜（约18小时）备用。2、打开超净工作台的风门开关，用酒精棉球分别擦拭手、工作台面、微量取液枪以灭菌。3、点燃酒精灯，用镊子取一支灭过菌的离心管置于离心管架上，作好标记。4、将装有菌液的锥形瓶瓶口部分在酒精灯火焰上过火灭菌后，打开盖子，用微量取液枪取1.5ml菌液于离心管中，将装有剩余菌液的锥形瓶瓶口在酒精灯火焰上灭菌后封口备用。5、将离心管置于离心机中，12000rpm离心1min。6、弃上清，将管口打开倒置于吸水纸上数秒使液体尽可能流尽。?7、加入100ul溶液I，用枪吹打悬浮后置于旋涡混合仪上振荡，使菌体充分悬浮，室温静置5min。?8、加入200ul新配制的溶液II，温和颠倒混匀，冰浴中静置5min。?9、加入150ul溶液III，轻轻颠倒混匀，冰浴中静置10min。?10、将管置于离心机中，12000rpm离心10min。?11、取上清，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，轻轻颠倒混匀，将管置于离心机中，12000rpm离心5min。?12、取上清