03 蛋白质化学-3课件.pptVIP

蛋白质的研究方法 —— 蛋白质的分离、定性定量以及测序 蛋白质分离纯化的一般原则 每种细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。为了研究蛋白质的结构与功能，需将其分离、纯化，尽量除去不需要的和变性的蛋白质。 所有的分离和纯化过程都必须在温和的条件下进行。 实质：①蛋白与非蛋白分开，②蛋白质之间分开 分离纯化蛋白质的程序 ①前处理 以适当方式将组织细胞破碎，使蛋白质以溶解状态释放出来，并保持其天然构象和原有生物活性。 动物组织：组织捣碎机、匀浆器和超声波破碎法； 植物组织：研磨或用纤维素酶处理； 微生物细胞：超声波法、高压挤压或溶菌酶处理。 前处理中的注意事项 组织破碎需加入适当缓冲液并在低温下进行，必要时加入蛋白酶抑制剂、巯基试剂等。对膜蛋白需加入去垢剂使膜结构瓦解，再用适当的介质提取。 若所要的蛋白质主要存在于某一细胞组分，如线粒体、叶绿体、细胞核等，可先用差速离心法将其分开，再以该细胞组分作为下一步分离提纯的材料。 差速离心法的步骤： ②粗分级 通常用盐析、等电点沉淀、超滤、有机溶剂分级等简便、处理量大的方法从蛋白质混合液中除去大量杂质，得到浓缩蛋白质溶液。 ③细分级 选用分辨率高的方法进一步提纯，如凝胶过滤、吸附层析、离子交换层析、反相高效液相层析、亲和层析以及凝胶电泳、等电聚焦等。 二、蛋白质分离纯化的方法 （一）根据分子大小不同的分离方法 1.透析和超过滤 透 析：利用蛋白质分子不能透过半透膜，使它与其它小分子化合物，如无机盐、单糖、双糖、氨基酸、小肽以及表面活性剂等分离。 半透膜：玻璃纸或高分子合成材料 超过滤：利用压力或离心力使小分子溶质通过半透膜而蛋白质被截留在膜上而分离。 2.密度梯度离心： 又称：离心沉降法——最常用的蛋白质分离方法。 蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，且每种蛋白质颗粒沉降到与其自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成不同的区带。 超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比。 常用离心介质：蔗糖和氯化铯 密度梯度离心 原理： 在强离心力作用下，蛋白质分子会发生沉降，并与溶液分离。利用物质密度的不同，经超速离心后，分布于不同的液层而分离。沉降速率取决于离心机转速、蛋白质颗粒的大小、密度、分子的形状、溶液的密度和性质等。 方法： 先加入适当的沉淀剂（如中性饱和硫酸铵溶液、酸、碱等），将蛋白质溶液转变成悬浮液，在不同的离心速度下，使不同大小和密度的蛋白质颗粒分离。 密度梯度离心的步骤 3.凝胶过滤（分子筛层析）： 介质：交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶颗粒。凝胶颗粒的内部是多孔的网状结构。 凝胶过滤的原理 原理：凝胶颗粒内部为多孔的网状结构。当大小不同的分子流经凝胶层析柱时，比凝胶孔隙大的分子不能进入珠孔内，从颗粒间隙穿过，行程短，被先洗脱下来； 而较小的分子可以进入凝胶颗粒内部，路径迂回曲折，行程长，后洗脱下来。 这样根据不同大小分子所经的路径不同而得到分离: ——大分子最先流出层析柱，小分子后流出。 凝胶过滤的步骤 （二）根据溶解度差别的分离方法 ? 等电点沉淀法： 蛋白质分子在等电点时，净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。 当蛋白质混合溶液pH被调到某一成分等电点时，则该蛋白质大部或全部将沉淀出来。 ? 盐析法： 蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，由于水化层被破坏和表面电荷被中和，容易发生沉淀。 中性盐在低浓度时可增加蛋白质的溶解度，即盐溶。原因是蛋白质分子吸附盐类离子后，而与水分子相互作用加强；当离子强度增大到足够高时，此时将夺取与蛋白质的水化层，且盐中和了蛋白表面的电荷，使蛋白质凝聚沉淀。 不同的蛋白质由于所带的电荷和水化程度不同，盐析时所需的盐的浓度也不相同，因而可以将不同的蛋白质加以分离。分段盐析——硫酸铵 ? 有机溶剂沉淀法： 在蛋白质溶液中，加入一定量的与水互溶的有机溶剂，由于这些溶剂与水的亲和力强，能够破坏蛋白质的 水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。 常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮等。 为了防止蛋白质在分离过程中发生变性，有机溶剂浓度不能太高，而且需要在低温条件下进行。 1.电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。 带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动。移动的速率： 区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。 （1）纸上电泳：用滤纸作支持物。 （2）凝胶电泳：用凝胶作支持物, （淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺） SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 SDS（十二烷基磺酸钠）：一种