05-基因克隆程第一章课件.pptVIP

基因克隆Gene Cloning 基 因 克 隆 第一章 绪论 第二章 基因工程的工具酶 第三章 基因工程载体 第四章 重组DNA导入受体细胞 第五章 目的基因的表达 第六章 基因文库技术 第七章 目的基因的分离技术 参考书 现代分子生物学与基因工程，李海英，化学工业出版社 基因工程原理，吴乃虎，科学出版社 基因工程，楼士林，科学出版社（21世纪高等教材） 第一章 绪 论 一、基因工程的概念（genetic engineering) 1、基因操作、遗传工程、重组体DNA技术 2、嵌合DNA、DNA嵌合体（DNA chimera) 3、分子克隆（molecular cloning) 基因克隆 (gene cloning) 重组DNA (recombinant DNA) 4、基因工程的操作步骤 1、基因克隆的操作步骤： 1）从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段。 2）在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。 3）将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞、宿主细胞），并与之一起增殖。 4）从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。 5）从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。 2、基因表达的操作步骤： 1）从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段。 2）将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。 二、基因工程发展简史 1972年，Stanford University（ivy-covered campus)， Berg，第一个体外重组的人工DNA分子（EcoR Ⅰ，SV40DNA，λDNA） 1973年，Cohen，完成了DNA分子体外重组和扩增的全过程，基因工程诞生之年，是基因工程的创始人 Stanvard University 三、基因工程的巨大意义 （一）利用微生物制药 1、利用微生物生产胰岛素 2、重组微生物生产生长激素 3、重组微生物生产干扰素 利用微生物生产胰岛素 世界上有6000万糖尿病患者（胰脏产生的胰岛素不足），400万定期注射胰岛素 在美国，每年人口增长率1%，糖尿病患者增长率5%-6%。 每位患者每年需要3-5kg的胰脏组织，40头牛或50头猪 1978年，2000L大肠杆菌培养液获得了100g 胰岛素，相当于从1t猪胰脏中提取的产量。 1980年，英国伦敦17位志愿者接受了基因工程胰岛素的注射。 1986年，基因工程生产的胰岛素正式进入市场 重组微生物生产生长激素 侏儒症 每个患者每年需要80个尸体的脑垂体，1%的病人能够接受治疗。 1979年，利用基因工程生产人生长激素 1987年，产品进入市场 1998年，美国有3000名儿童接受了治疗 从脑垂体细胞中分离人生长激素的 mRNA 通过逆转录酶 合成 cDNA（由于生长激素基因前面有一段信号肽的DNA大肠杆菌不能识别，不能产生正确的有活性的生长激素） 用内切酶切去这个基因上的信号肽DNA序列 化学方法合成一段DNA 合成的基因插入到质粒中 导入大肠杆菌生产人生长激素。 重组微生物生产干扰素 1957年，被确定具有抗病毒的特性，分为αβγ三类 1980年，破译了α干扰素的全部遗传密码，利用大肠杆菌进行生产，可以治疗肝炎和抑制肿瘤。 （二）克 隆 技 术 (clone technology) 克隆的概念 克隆是英文 “clone”的音译，源于希腊文“klon”，原意是指植物幼苗或嫩枝以无性繁殖或营养繁殖的方式培育，也就是指用除种子之外的植物体的任何一部分进行无性繁殖。 凡是没有精卵结合过程，而由同一个祖先细胞获得的两个以上的细胞、细胞群或生物体，或是由同一个亲本DNA序列产生子代DNA 的方式就是克隆，用这种方式分化发育得到的生物体与母体的基因是完全相同的。 克隆是指生物体通过体细胞进行的无性繁殖，以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群。 A羊 B羊 从雌性成年绵羊 从B羊取