06第六章 免疫学技术课件.pptVIP

第六章 免疫学检测技术 第一节、抗体的制备 一、抗血清的制备 （一）用于免疫的动物 、 主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等， 动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量， 一般制备免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清。 用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，雄性， 注意饲养，消除动物的个体差异，及免疫过程中死亡的影响。 家兔中纯种新西兰兔最好，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。 （二）免疫途径 多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等， 一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。 途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。 （三）佐剂 注射抗原时加入的一类能增强抗原的抗原性、刺激机体产生较强免疫反应的物质，称为免疫佐剂。 佐剂的作用： 延长抗原体内存留时间 增加抗原刺激作用 刺激免疫活性细胞增多 促进T细胞与B细胞互作。 不完全福氏佐剂：羊毛脂：石腊油=1： 5，视需要可调整为1：2～9（V/V）， 福氏完全佐剂：在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗。 配制方法： 按比例将羊毛脂与石腊油置容器内，用超声波混匀，高压灭菌，置4℃下保存。 免疫前取等容积佐剂与免疫原溶液混合，振荡器混匀成乳状，也可研磨均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液，加完后再继续研磨成乳剂，至滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。 为避免损失抗原，亦可用一注射器装抗原液，另一注射器装佐剂，二者以聚乙烯塑料管连接，然后二者来回反复抽吸，约数十分钟后即完全乳化。 （四）免疫方法 抗原剂量：首次剂量为300～500μg，加强免疫的剂量约为首次的1/4左右。 每2～3周加强免疫一次。加强免疫时用不完全佐剂， 首次免疫时皮下注射百日咳疫苗0.5ml，加强免疫时不用。 第2次加强免疫后2周，耳缘静脉取血2～3mL，制血清，测抗体效价。 如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止。 抗体效价达到预期水平时，即可放血制抗血清。 图2-3 抗体反应 （五）抗血清的采集与保存 耳缘静脉或耳动脉放血 颈动脉入血 心脏采血 耳缘静脉或耳动脉放血： 将兔放入一个特造的木匣或笼内，耳露于箱（笼）外，也可由另一人捉住兔身。 剪去耳缘的毛，用少许二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管扩张、充血。 用手轻拉耳尖，以单面剃须刀或尖的手术刀片，快速切开动脉或静脉，血液即流出，每次可收集30～40ml 。 然后用棉球压迫止血，凝血后洗去二甲苯。 二星期后，可在另一耳放血。此法可反复多次放血。 颈动脉放血： 将兔仰卧，固定于兔台，剪去颈部的毛，切开皮肤，暴露颈动脉，插管，放血。放血过程中要严格按无菌要求进行。 血清析出： 收集的血液室温下1h左右凝固，然后置4℃过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。在无菌条件，吸出血清，分装（0.05～0.2mL），贮于-40℃以下冰箱，或冻干后于4 ℃冰箱保存。 （六）抗血清质量的评价 不同的动物，同一动物在不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等都可能发生变化。 必须经常采血测试。 只有在对抗血清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后，才可使用所取得的抗血清。 　1．抗血清的效价：就是指血清中所含抗体的浓度或含量。 （1）放射免疫法： 以不同稀释度的抗血清与优质放射性标记抗原混合，孵育24h后，测定其结合率。 通常以结合率为50%的血清稀释度为效价。 结合率：放射强度的检测的变化 如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1：15000，则该血清的效价就是1：15000。 影响抗血清的效价测定的因素 抗血清本身的性质 受标记抗原的质量 孵育时间 所用稀释液的成分 pH （2）双向扩散法： 利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两者在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。 　　 球脂板的制备：100ml pH7.1 的磷酸盐缓冲液加到15g的琼脂内，于水浴中加温，搅拌，使琼脂完全溶解，趁热用纱布过滤，待溶液冷却到65℃左右时，加入叠氮钠（NaN3），使其在溶液中的浓度为0.1%。用移液管把琼脂放在干净平皿或玻片上，约3mm厚，待其冷却，完全凝固后，用打孔器打孔（图2-4）。 中央孔内加适量抗原（容量为50μl），周围各孔内分别加入50μl 1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀释的抗血清，37℃下孵育24h，观察有无沉淀线产生，以判断血清的稀释度（图2-5）。 2．特异性测定 　　 特异性：抗血清对相应的抗原及近似的抗原物质的识别能力。 特异性是以交叉反应率来表示。 交叉反应率低，表示抗血清的特异性好，反之则特异性差。 交叉反