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第二章 DNA克隆技术 本章，我们讨论4个问题： 1. 什么是DNA克隆技术——DNA克隆技术的概念。 2. 为什么能进行DNA克隆技术——DNA克隆技术的原理和技术路线。 3.怎样进行DNA克隆技术——DNA克隆技术的步骤（DNA体外重组，重组DNA导入宿主细胞后扩增和表达，基因工程后处理） 4. DNA克隆技术的应用和前景——对于医学来说即生产基因工程产品、开展基因治疗等。 DNA克隆/ 基因克隆/ 分子克隆 将重组的DNA通过一定方式导入宿主细胞内，并且在宿主细胞中进行复制扩增，形成大量与亲代分子完全相同的子代DNA分子的过程。 克隆的含义 DNA克隆： 分子水平 细胞克隆： 细胞水平 克隆羊： 无性繁殖 个体水平 （一）基因（gene） 基因 从化学上来说，指的是一段DNA或RNA顺序，该顺序可以产生或影响某种表型（genotype，phenotype），从遗传学上来说，基因代表一个遗传单位，一个功能单位，一个突变单位。 （二）基因工程（genetic engineering） 基因工程 有目的的通过分子克隆技术，人为操作改造基因，改变生物的遗传性状的系列过程，总称为基因工程。 第一节 概论 一、历史 1944 肺炎双球菌转化实验证实DNA是遗传物质 1953 DNA双螺旋模型 1960’s 遗传密码、中心法则 1970 反转录酶 1946 质粒 1968-70 限制酶 1972 不同来源的DNA片段体外连接成重组DNA分子 1973 转化、筛选重组质粒的阳性克隆 The transforming principle is DNA. 二、基因克隆的特点和技术路线 技术路线： 1 分离制备目的DNA片段和载体 2 目的DNA与载体的剪切 3 目的DNA与载体的连接 4 重组DNA分子转化宿主细胞 5 筛选阳性克隆，大量扩增 特点：分子水平操作，细胞水平表达 基因克隆技术路线 一、限制性内切酶 定义：特异性识别双链DNA并进行切割的酶。 内切：在DNA内部切割 限制性：识别特异位点切割 GAATTC CTTAAG EcoRⅠ酶切位点 ? 命名（1973年Smith 原则、Ⅱ型酶） 根据分离此酶微生物的学名，一般取3个字母。 第一个字母大写 该微生物属名前的第一个字母 第二、三个字母小写 该微生物种名前的2个字母 第四个字母大写 有变种或品系的第一个字母 罗马字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 从一种微生物中发现了几种不同特异性限 制酶，按发现顺序排列 如EcoRⅠ是指从大肠杆菌（Escherichia coli）R 株分离得到的第一种限制酶。 命名 酶的来源 Haemophilus influenzae d 属名 种名 株系 酶的名称 Hind Ⅰ Ⅱ Ⅲ 分类 Ⅰ Ⅱ Ⅲ DNA底物 双链DNA 双链DNA 双链DNA 辅因子 Mg2+ ATP SAM Mg2+ Mg2+ ATP 识别序列 特异 特异 特异 切割位点 非特定 特定 特定 识别序列前后 之中 之后25bp~27bp 100-1000bp 修饰作用 有 无 有 限制酶的识别位点