3-zhou目的蛋白质表达、纯化、检测课件.pptVIP

实验目的 重点掌握表达载体构建的原理及方法 掌握目的基因原核诱导表达的原理及方法 了解目的蛋白质 “标签”纯化的基本原理和方法 掌握PAGE变性凝胶电泳的原理及方法 掌握考马斯亮蓝染色的方法 目的蛋白质的诱导表达 目的蛋白质的纯化 目的蛋白质的检测 蛋白质的表达：将克隆基因插入合适载体后导入宿主细胞表达大量蛋白质的方法。 体内很难分析单个蛋白质的作用 进行大量表达和纯化是为了在体外进行研究 应用于蛋白纯化、定位及功能分析等方面 原核细胞表达系统菌株 菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。 堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型，也是我们非常熟悉的表达菌株。 大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因，为T7表达系统而设计。 原核表达质粒的构建 目的基因 表达载体 目的基因 / DNA / PCR / 酶切 / Primer 例： p38中抑制多肽16肽序列 GGA AGA ACA TTG TTT CCT GGT ACA GAC CAT ATT GAT CAG TTG AAG CTC F 5’-ACG GAT CC TA GGA AGA ACA TTG TTT CCT GGT-3’ R 5’-ACG GAT CC TTA GAG CTT CAA CTG ATC AAT ATG G-3’ 5’端引物中AC是随机保护碱基，G GAT CC是BamH I酶切位点，TA是为防止移码而引入的两个碱基，随后是编码16肽前7个氨基酸的碱基序列。 3’端引物中AC是随机保护碱基，G GAT CC是BamH I酶切位点，TAA是终止密码子的反向互补序列，随后是从编码16肽碱基序列的最后一个碱基开始的反向互补序列。 表达载体 能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中;在基本骨架的基础上增加表达元件，就构成了表达载体。 元件 启动子、终止子、核糖体识别序列 诱导性表达所需要的元件 操纵子序列 调控基因 多克隆位点 融合Tag 复制起始序列 筛选标记/报告基因 各种表达载体的不同之处 在于其表达元件的差异。 启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的启动子， 转录终止子 核糖体结合位点 用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽 （Tag）。 标签位于表达载体的多克隆位点的N端或者C端，能够与目的基因融合表达（N端或者C端融合表达）。 目前常用的标签有 组氨酸标签（His-Tag） 谷胱甘肽S转移酶（glutathione S transferase）标签（GST-Tag） 硫氧还蛋白（thioredoxin, Trx）标签 麦芽糖结合蛋白（Maltose Binding Protein, MBP） 蛋白质 A（protein A） 纤维素结合位点（cellulose binding domain）标签等。 一般对于小分子用较大的Tag（如GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小Tag（如His）减少对目的蛋白的影响。 筛选标记/报告基因表达 抗药性基因，Amp是最常见的筛选标记，kana，新霉素，四环素，红霉素和氯霉素。 抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。 GFP（绿色荧光蛋白）是最常用的报告基因了，半乳糖苷酶，荧光素酶。 一些融合表达Tag也有报告基因的功能。 常用表达载体 pGEX系列载体是谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白表达系统的载体。 Ptac Promoter Amp pGEX - KG pET系列的载体是His6融合蛋白的表达载体。 T7 Kana pET - 14b 目的蛋白质的诱导表达 lacI q（Lactose） lacI是大肠杆菌中lac 操纵子（Operon）的调节基因，它所表达的阻遏蛋白是lac 操纵基因（Operator）的抑制因子，抑制转录启动。 当有乳糖存在时，这种阻遏蛋白能与过量的乳糖结合而失去对操纵基因的抑制，使lac 操纵子上的结构基因lacZ（β-半乳糖苷酶)、lacY（透性酶)、lacA(乙酰基转移酶）得以正常表达，启动转录。 IPTG（异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷) 作为乳糖的类似物与lacI阻遏蛋白结合而使操纵基因不被抑制，因此IPTG经常作为lac 操纵子的诱导剂而使用。 原核表达的诱导条件 IPTG浓度： 0.01-5mmol/L 诱导时间：～3h 诱导温度：15-42℃ 目的蛋白质的纯化 破碎细胞 超声破碎 溶菌酶裂解 从细胞蛋白中纯化出GST和His融合蛋白