4-核酸分子杂交技术2011课件.pptVIP

主要内容 第一节 分子杂交技术的理论基础 第二节 核酸分子杂交的方法 第三节 核酸杂交的探针 一、DNA变性与复性 核酸分子杂交实验步骤： 印迹转移：将核酸样品转移到固相支持物滤膜上 主要三种方式：毛细管虹吸作用 真空抽滤作用 电场作用 常用的固相支持物(滤膜) 尼龙滤膜 硝酸纤维素滤膜 叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM） 二乙氨乙基纤维素滤膜（DEAE） 滤膜的选择 核酸的特殊性、分子大小 杂交过程中所涉及的步骤的多寡及敏感性等参数 硝酸纤维素滤膜：不能滞留小于150bp的DNA片段 不能同RNA结合 广泛变性后的RNA很容易转移到硝酸纤维素滤膜 （P.S.Thomas, 1983） 改变缓冲液可以改善硝酸纤维素滤膜对小片段DNA的滞留能力 (G.E.Smith,1980 :1mmol/L CH3COONH4和0.2mmol/L NaOH缓冲液代替SSC) 尼龙滤膜 较为理想的固相支持物 结合核酸能力强 转膜后可多次重复使用（每次杂交的探针可以洗去而结合的DNA酶切片段不容易被洗去） 缺点： 杂交信号的本底较高 Western印迹杂交 检测的蛋白质经PAGE凝胶电泳并染色后，转移到滤膜上固定，然后用“抗原-抗体”免疫反应或“DNA-Protein”结合反应来鉴别滤膜上的蛋白质 Western印迹法步骤 先将蛋白通过SDS电泳分离开来， 再利用电场力的作用将胶上的蛋白转移到固相载体（NC膜）上， 然后加抗体形成抗原抗体复合物， 利用发光或显色原理将结果显示到膜或底片上 斑点印迹杂交（dot blotting）狭线印迹杂交（slot blotting） 更适于核酸样品的定量检测 原理与Southern杂交相同 在实验过程中，使用特殊设计的加样装置，使众多的待检测样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵 原位杂交（in situ hybridization） 生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑是按照原来的位置不变地转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用 1975年 Grunstein和Hongess 发展起来的 化学及生物学意义上的探针(probe) 指与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子 抗体-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生长因子-受体的相互作用 每一种病原体都具有独特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可制备出探针，用于疾病的诊断等研究 1、放射性标记探针 用放射性同位素做为标记物。放射性同位素是最早使用，也是目前应用最广泛的探针标记物。常用的同位素有32P、3H、35S。其中，以32P应用最普遍 优点：灵敏度高，可以检测到Pg级； 缺点：辐射危害（易造成放射性污染） 同位素的半衰期限制 杂交信号的检测 当探针是放射性标记时，杂交信号的检测通过放射自显影进行 非放射性标记的探针，则需将非放射性标记物与检测系统偶联，再经检测系统的显色反应来检测杂交信号 非放射性核素探针的检测 1、偶联反应：半抗原—通过抗原—抗体反应与显色体系偶联 配体—亲和法与显色体系偶联：生物素-抗生物素蛋白-酶（Avidin-Biotin-Enzyme-comples, ABC） 2、 显色反应：通过连接在抗体或生物素蛋白的显色物质如酶、荧光素等进行杂交信号的检测 A、酶学检测：是最常用的方法，通过酶促反应使底物形成有色产物。最常用的酶是辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AKP），也有使用酸性磷酸酶、和β-半乳糖苷酶 A：酶学检测 B、荧光检测：常用的有异硫氰酸荧光素（FITC）和罗丹明（TRITC），可被紫外线激发发出荧光而被检测到。主要用于原位杂交。 C、化学发光法：是指在化学反应过程中伴随的发光反应。目前常用的是辣根过氧化物酶（HRP）催化鲁米诺（luminol）伴随的发光反应。适合于Sourthern、Northern及斑点杂交 D、电子密度标记：利用重金属的高电子密度，在电子显微镜下检测，适合于细胞原位杂交 核酸分子杂交实验因素的优化 探针的选择、标记方法、浓度 杂交率 杂交最适温度、反应时间 杂交促进剂 第三节 核酸杂交的探针 ①同源或部分同源基因组DNA探针 ②总cDNA探针 和 特异cDNA探针 (诊断试剂) ③RNA探针 ④人工合成寡核苷酸探针 (检测点突变和小段碱基的缺失或插入) 一、常用探针类型： 1、按来源及性质划分 2、按标记物划分 ①放射性标记探针 ②非放射性标记探针 二、标记物 理