细胞第三章课件.ppt

A. The technique of differential centrifugation Step-by-step procedure for the purification of organelles by differential centrifugation. S dx/dt /?2x 1?10-13sec. Figure 3-16. The preparative ultracentrifuge. Figure 3-17. Cell fractionation by centrifugation. Repeated centrifugation at progressively higher speeds will fractionate homogenates of cells into their components. In general, the smaller the subcellular component, the greater is the centrifugal force required to sediment it. Typical values for the various centrifugation steps referred to in the figure arelow speed: 1,000 times gravity for 10 minutes medium speed: 20,000 times gravity for 20 minutes high speed: 80,000 times gravity for 1 hour very high speed: 150,000 times gravity for 3 hours * Figure 3-18. Comparison of methods of velocity sedimentation and equilibrium sedimentation. 细胞不同组分沉降率不同，主要依赖于它们的形状和大小，通常以沉降系数S来表示 沉降系数是指悬浮在密度较低的溶剂中的一种溶质大分子，在每单位离 心场作用下的沉降速率 。 二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类、脂质等到的显色方法 原位成分分析常利用一些显色剂与所检物质的特殊基团特异性结合的特征，通过染色反应的部位和颜色的深浅来断某种物质在细胞内的分布与含量。 福尔根 Feulgen 反应可特异显示DNA的存在部位。 PAS反应可确定多糖的存在。 四氧化锇 可证明脂肪滴的存在。苏 丹 Ⅲ和苏丹 黑也常用于脂肪的鉴定。 米伦反应及重氮反应等用来测定蛋白质。 检测和定位酶的技术是基于细胞或组织切片与适宜底物共同孵育，通过一定方法使产物显示出来 。例如检测碱性磷酸酶的格莫瑞方法。 三、特异蛋白质抗原的定位与定性 免疫荧光和免疫电镜是最常用的细胞内蛋白质定位技术。 1、免疫荧光技术 免疫荧光技术就是将免疫学方法与荧光标记技术 相结合研究特异蛋白质抗原在细胞内分布的方法。 Figure 3-19. Indirect immunocytochemistry. The method is very sensitive because the primary antibody is itself recognized by many molecules of the secondary antibody. The secondary antibody is covalently coupled to a marker molecule that makes it readily detectable. Commonly used marker molecules include fluorescein or rhodamine dyes, the enzyme horseradish peroxidase or colloidal gold spheres, and the enzymes alkaline phosphatase or peroxidase. 2、免疫电镜技术 免疫电镜技术使特异蛋白的定位与超 微结构结合起来，使抗原定位更准确。如蛋白分泌的研究胞内酶 的研究；一些结构蛋白的研究。 四、细胞内特异核酸的定位与定性 1、原位杂交技术 用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序列在染色体上或细胞中的位置的方法。 2、Southern技术（了解） 蛋白样品经电泳后，与DNA探针进行吸附，与DNA有亲合作用的蛋白带被显示出来。 五、利用放射性标记技术 研究生物大分子在细胞内的合成动态 放射自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶的感光作用，对样