细胞免疫荧光实验步骤课件.doc

细胞免疫荧光实验步骤细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下:1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时.2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟3.PBS洗净:3min＊34.1%Triton: 30min.配成50ultriton+5mlpBS5.PBS洗净:2＊5min6.羊血清封闭：３７度，２０分钟７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度　１－２小时８.４度　PBS洗净，３min＊５次９.二抗　３７度小于一小时加入5ug/ml的FITC-鬼笔环肽室温染色30-60分钟１０.３７度　PBS洗净，３＊５min　　凉干封片（封闭液ＰＨ８.５）　　我的实验检测X射线照射鼻炎癌细胞后γH2AX的数量变化预实验步骤：1） 辐照结束后，弃去旧培养液，4%多聚甲醛4固定15分钟。2） PBS洗涤，5分钟×3次。3） 体积分数为0.2%Triton-X 100 4破膜15分钟。4） PBS洗涤，5分钟×3次。5） 羊血清工作液室温封闭2小时。6） PBS洗涤，5分钟×3次。7） 0.21μg/ml一抗（梯度1:500 1:750 1：1000）37孵育细胞2小时。8） PBS洗涤，5分钟×3次。9） 2.1μg/ml 二抗（1：200）37避光孵育细胞1小时。10）PBS洗涤，5分钟×3次。11）1μg/ml DAPI染色15分钟，使用时避光。12）PBS 洗涤，5分钟×3次。13）以及分数90%甘油封片，盖玻片细胞面朝下。14）荧光显微镜下观察。　 活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备（一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、　　　　　胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　用10％FCS　RPMI1640调整细胞浓度为　　　　　　　　　5×10６～１×10７／ml　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)　　　　　　　　的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS　　　　　　　　稀释)灭活正常兔血清　　　　　　　　　　　　　　　　　↓4℃ 30min　　　　　　　　用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右　　　　　　　　　　　　　　1000rpm×5min　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠　　　　　　　　　(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　4℃ 30min　　　　　　　　　用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右　　　　　　　　　　　　　　1000rpm×5min　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入　　　　　　　　　1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，　　　　　　　　　视细胞浓度加入100～500μl固定液)　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　FCM检测或制片后荧光显微镜下观察　　　　　　　　　　(标本在试管中可保存5～7天)（二）试剂和器材　　1.　各种特异性单克隆抗体。　　2.　荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。　　3.　10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。　　4.　玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。（三）注意事项　　1.　整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。　　2.　洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。　　3.　加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。　　4.　细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。　　附:　　1. DPBS (×10, 贮存液)　　　　NaCl 80g　　　　KCl 2g 　　　　　蒸馏水加至1000ml　　　　Na２HPO４ 11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释　　　　KH２PO４ 2g　　2.　洗涤液　　　　DPBS　　　　　　900ml　　　　FCS 50ml (终浓度　5％)　　　　4％NaN３???50ml (终浓度0.2％)　　3.　固定液　　　　DPBS　　　　1000ml　　　　葡萄糖　　　　20g (终浓度2％)　　　　甲　醛　　　　10ml　　　　NaN３　　　0.2g (终浓度0.02％) 4.　玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。（三）注意事项　　1.　整个操作