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细胞免疫荧光实验步骤细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下:1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时.2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟3.PBS洗净:3min*34.1%Triton: 30min.配成50ultriton+5mlpBS5.PBS洗净:2*5min6.羊血清封闭:37度,20分钟7.一抗,4度过夜,一般要大于18小时或者37度 1-2小时8.4度 PBS洗净,3min*5次9.二抗 37度小于一小时加入5ug/ml的FITC-鬼笔环肽室温染色30-60分钟10.37度 PBS洗净,3*5min 凉干封片(封闭液PH8.5) 我的实验检测X射线照射鼻炎癌细胞后γH2AX的数量变化预实验步骤:1) 辐照结束后,弃去旧培养液,4%多聚甲醛4固定15分钟。2) PBS洗涤,5分钟×3次。3) 体积分数为0.2%Triton-X 100 4破膜15分钟。4) PBS洗涤,5分钟×3次。5) 羊血清工作液室温封闭2小时。6) PBS洗涤,5分钟×3次。7) 0.21μg/ml一抗(梯度1:500 1:750 1:1000)37孵育细胞2小时。8) PBS洗涤,5分钟×3次。9) 2.1μg/ml 二抗(1:200)37避光孵育细胞1小时。10)PBS洗涤,5分钟×3次。11)1μg/ml DAPI染色15分钟,使用时避光。12)PBS 洗涤,5分钟×3次。13)以及分数90%甘油封片,盖玻片细胞面朝下。14)荧光显微镜下观察。
活细胞免疫荧光技术-流式细胞仪标本的制备(一)制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10%FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×106~1×107/ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5~50μl) 的小玻璃管或塑料离心管,再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次,每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 弃上清,加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物,充分振摇 ↓ 4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次,每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本,一般加入 1ml固定液,如制片后在荧光显微镜下观察, 视细胞浓度加入100~500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5~7天)(二)试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体,灭活正常兔血清。 3. 10% FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。(三)注意事项 1. 整个操作在4℃下进行,洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分,以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合,出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体,降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好,否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液) NaCl 80g KCl 2g 蒸馏水加至1000ml Na2HPO4 11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释 KH2PO4 2g 2. 洗涤液 DPBS 900ml FCS 50ml (终浓度 5%) 4%NaN3???50ml (终浓度0.2%) 3. 固定液 DPBS 1000ml 葡萄糖 20g (终浓度2%) 甲 醛 10ml NaN3 0.2g (终浓度0.02%)
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。(三)注意事项 1. 整个操作
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