双杂交技术课件.ppt

2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用　　利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。例如：来源于矮牵牛的黄烷酮醇还原酶DFR与其抗体scFv的反应中，抗体的单链的三个可变区A4、G4、H3与抗原之间作用有强弱的差异。Geert等利用酵母双杂交技术，将DFR作为诱饵蛋白，编码抗体的三个可变区的基因分别被克隆在AD-LIBRARY载体上，将BD-BAIT载体和每种AD-LIBRARY载体分别转化改造后的酵母菌株中，并检测报告基因在克隆的菌落中的表达活性，从而在活细胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反应。 3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药 物对蛋白质之间相互作用的影响　　酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETA-importin的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。 　4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（Genome Protein Linkage Map）众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。 Advantages and limitations of the yeast two-hybrid system 特点与优点 ⑴ 作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因子的作用而给出的， 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 ⑵ 检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。 ⑶ 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。 ⑷ 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库， 能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。例如已报道成功分析了RAP1与RIF1ii、P21cip1与CDK2iii、p16与CDK4iv等之间的相互作用。 酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点: 酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法， 有多方面的应用， 但仍存在一些局限性。 ⑴ 双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内， 而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等， 这些反应在核内无法进行。 另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助， 这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。 ⑵ 酵母双杂交系统的一个重要的问题是假阳性。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用， 使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域， 能与其他蛋白形成稳定的复合物， 从而引起报告基因的表达， 产生假阳性结果。 局限性 许多研究者对双杂交系统进行了改进和发展，。例如采用假阳性显示分析法和双筛选系统以减少假阳性的发生；发展哺乳动物双杂交系统更好地研究蛋白将的相互作用。其中双筛选系统用二种不同的报告基因(常用lacZ和HIS3)有以下优势:⑴ 用不同的启动子表达位于酵母二个染色体上的报告基因， 可明显减少假阳性。⑵ 通过营养型筛选增强了筛选能力， 尤其适用于对较大的库容量而被选蛋白较少情况下的筛选。 参考书： 1、《精编分子生物学实验指南 》F。奥斯伯 等著 颜子颖 王海林译 科学出版 社 出版 2、《蛋白质组学：理论与方法 》钱小红 贺福初 主编 科学出版社出版 3、《protein-protein interaction: A molecular cloning manual》 Erica