第六章酶分子的化学修饰分解.ppt

3.体内半衰期延长 经修饰后，分子量增大，免疫原性及抗原性降低或消除，增强了抗蛋白水解酶、抗抑制剂和失活因子的能力。 4.最适pH及米氏常数等酶学性质发生一定变化 米氏常数一般增大。 重点： 化学修饰的意义； 大分子化学修饰的方法，了解其基本过程； 大分子化学修饰对酶学性质的影响。 * * * * * * 化学修饰反应的类型 1) 烷基化反应 试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基团（如－NH2，-SH等）发生烷基化。 可作用基团： 氨基（Lys，Arg），巯基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。 修饰剂：2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。 烷基化反应 2) 酰基化反应 试剂特点： 含有 结构，作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化。 可作用基团： 氨基，巯基，醇羟基（Ser、Thr），酚羟基（Tyr） 酰基化反应 3) 氧化和还原反应 试剂特点：具有氧化性或还原性。 氧化剂：H2O2 可被氧化的侧链基团:巯基，甲硫基，等。 还原剂：2－巯基乙醇、DTT等。 可被还原的侧链基团：二硫键。 氨基酸 侧链基团 修饰剂 Lys 氨基 三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸 Asp、Glu 羧基 水溶性碳化二亚胺 Arg 胍基 苯乙二醛，1,2－环己二酮、丁二酮 Cys 巯基 碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺 二硫键 巯基乙醇、DTT His 咪唑基 焦碳酸二乙酯、碘乙酸 Tyr 酚羟基 碘、四硝基甲烷 Trp 吲哚基 N-溴代琥珀酰亚胺 各种氨基酸侧链的修饰剂 第三节 酶蛋白侧链的大分子修饰 常用修饰剂：聚乙二醇(PEG)、右旋糖苷、环糊精、蔗糖聚合物(Ficoll)、肝素、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚丙烯酸(PAA)、聚氨基酸、等。 活化：修饰剂的活化，即制备修饰剂衍生物。 偶联：与酶蛋白偶联反应。 1.迅速被体内酶降解 2.肾小球过滤清除 3.抗原－抗体反应 4.溶解度差导致沉淀 蛋白质药物在使用中出现的问题 T C 实际浓度 理想浓度 protein Half life in vivo(h) Injections/week α-IFN β-IFN HGH EPO G-CSF GM-CSF 5.6 0.6 0.3 6 5 2 3 3 7 3 7 7 各类蛋白类药物的体内半衰期及注射次数 IFN-α2a and 40 kDa (PEG)–IFN-α2a的药代动力学 酶 半衰期 相对稳定性 天然SOD 6 min 1 右旋糖酐-SOD 7 h 70 Ficoll(低分子量)–SOD 14 h 140 Ficoll(高分子量)–SOD 24 h 240 聚乙二醇-SOD 35 h 350 蛋白类药物修饰后的半衰期及稳定性 1.PEG（Polyethylene Glycol）简介： ①?具有两亲性; ②?无毒，免疫原性低; ③?分子量范围很宽，从几百到数十万，选择余地大; 修饰剂一般为500～20000 ④?可以将它的许多优良性质:如亲水性，柔性、抗凝血性、抗巨噬细吞噬性等，赋予修饰后的生物分子。 H(-O-CH-CH)n-OH 为避免在修饰过程中发生交联和团聚，通常采用单甲氧基聚乙二醇(mPEG)作为修饰剂。 CH3(-O-CH-CH)n-OH 2.PEG的活化 1 )三氯均嗪法 MPEG1 MPEG2 均三嗪，三聚氯氰 消化酶作用下的过氧化氢酶的活性保留 第一代PEG衍生物： 线性PEG，分子量一般较小（12kD）； 反应选择性低，产物为为非均一的混合物； 修饰后蛋白药物的抗原性和半衰期改进效果不明显； 容易引发蛋白质的交联与团聚； 衍生物与药物反应形成的连接键稳定性不高。 1. N-末端氨基修饰 PEG-醛 蛋白质 N 端 α 氨基的 pKa 为 7.6~8.0，而分子内赖氨酸的 ε-氨基的 pKa 为 10.0~10.2 mPEG-醛与 N端氨基的偶联 第二代PEG衍生物 2.疏基修饰 ①PEG-马来酰亚胺；②PEG -乙烯基砜； ③PEG -碘乙酰胺；④PEG -吡啶-二硫醚。 3.羧基端的修饰 mPEG-酰肼或mPEG-胺 mPEG-酰肼与羧基的偶联 枝形PEG 单链叉形PEG 多链叉形PEG 产品号 末端基团 分子量 包装（g） 价格（￥） mPEG-OH5 -OH 5K 100 10 3500 700 mPEG-OH10 -OH 10K 100 10 7000 1400 mPEG-OH2