重组dna技术.ppt.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 左下角处有超级链接到配伍末端 * * * * * * * * * * * Artificial linker （人工接头） 第五节 重组DNA导入受体细胞 受体菌的条件 安全宿主菌 遗传背景清楚！ HB101；JM109；DH5a 处于感受态(Competent cells) 即容易接受外源DNA的状态。 特殊处理 受体细胞 转化(Transformation): 是将外源DNA分子引入受体细胞, 使之获得新的遗传性状的一种手段。 电击法 CaCl2 转化的主要方法 导入方式 转化 (transformation)：质粒为载体 转染 (transfection)：噬菌体和病毒为载体 其原理是： 细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形; 转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面; 经42℃短时间热击处理，可促进细胞吸收DNA复合物。 受体细菌 50-100mmol/L CaCl2 感受态细菌 重组体转入细菌 CaCl2处理 基因重组 转染 体外包装 噬菌体 噬菌体体外包装 第六节 重组DNA分子的鉴定 基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性。 通过细菌培养以及重组子的扩增，获得所需的基因片段的大量拷贝。进一步研究该基因的结构、功能，或表达该基因的产物。 利用宿主细胞遗传表型的改变来筛选 抗药性标志筛选 插入失活 β－半乳糖苷酶系统筛选 分析重组子分子结构特性进行鉴定 内切酶图谱鉴定 Southern 印迹杂交 菌落原位杂交 PCR鉴定 测序 1. 抗药性标志的筛选 如果克隆载体带有某种抗药性标志基因如ampr或tetr ，转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗菌素的平板上幸存并形成菌落，这样就可将转化菌与非转化菌区别开来。 如果重组DNA时将外源基因插入标志基因内，该标志基因失活，通过有无抗菌素培养基对比培养，可区分单纯载体或重组载体（含外源基因）的转化菌落。 插入失活 抗药性标志的选择 pBR322 Amp Tet 插入片段 Amp平板 Tet平板 DNA重组体与质粒自身环化的鉴别：插入失活法 Ampr Tets Ampr Tetr Screening of the clone The medium in this petri dish contains the antibiotic Kanamycin The bacteria on the right contain Kanr, a plasmid that is resistant to Kanamycin, while the one on the left has no resistance Note the difference in growth β－半乳糖苷酶系统筛选（蓝白斑筛选） 很多载体都携带一段细菌的lacZ基因，它编码β－半乳糖苷酶N-端的146个氨基酸，称为α－肽； 载体转化的宿主细胞为lacZΔ15基因型，它表达β－半乳糖苷酶的C-端肽链； 当载体与宿主细胞同时表达两个片段时，宿主细胞才有β－半乳糖苷酶活性，使特异的底物X-gal 变为兰色化合物，这就是所谓的α－互补； 而重组子由于基因插入使α－肽基因失活，不能形成α－互补，在含X-gal的平板上，含阳性重组子的细菌为无色菌落或噬菌斑。 标志补救（ α互补，?-半乳糖苷酶法） lacZ Am N2H ?片段 COOH ?片段 X-gal Lac Z 蓝色化合物 X-gal：5- 溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 α 互补的检测 目 录 lacZ Blue/White Color Screening with Recombinant Plasmids 3. 内切酶图谱鉴定 经初筛鉴定有重组子的菌落，小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA,用相应的内切酶切割，释放出插入片断。 凝胶电泳检测 加样孔 DNA Marker 空质粒 重组质粒 重组质粒酶切 重组质粒的PCR扩增片段 4. 通过PCR筛选重组子 一些载体的外源DNA插入位点两侧存在特定的序列，如启动子序列等，利用这些特异性序列作为引物，对小量制备的质粒DNA进行聚合酶链反应（PCR）分析，不但可迅速扩增插入片断，判断是否阳性重组子，还可直接对插入序列进行DNA 序列分析。 5. 菌落或噬菌斑原位杂交 先将转化菌落或噬菌斑直接铺在硝酸纤维素膜或琼脂平板上，再转移至另一膜上，然后用标记的特异DNA探针进行分子杂交，挑选阳性菌落。