脐血干细胞分化与应用1概述.ppt

成年后EPC 主要分布于骨髓,外周血液中也有少量EPC ,约为2～4 EPC/ ml , 在急性心肌梗死时为10 ～40 EPC/ ml ,脐带血中可达1000～4000 EPC/ ml ,其特异的细胞表面标志为CD34 + 、Flk21 + 与AC133 + 。 VEGF 是EPC 的增殖与分化的必需诱导因子, GM-CSF 也促进EPC 的增生与分化, 而血管抑制素(angiostatin) 起抑制作用。此外,他汀类药物可将EPC 从骨髓动员至外周血并增加其功能与活性。 动物实验： 1）给后肢缺血的裸鼠注入人脐血EPC 能显著增加局部血流量与微血管密度。 2）给心肌梗死的裸鼠静脉注射EPC 可促进新血管的形成,并减少缺血心肌细胞的凋亡。 3）年幼(3 月) 小鼠骨髓EPC 能促进老年(18 月) 小鼠的心肌血管增生与心脏功能改善。 4）将VEGF 基因转染至EPC ,使后者具有更高的增殖活性与功能,动物实验已证实,转染有VEGF的EPC 增加细胞的增殖与参与血管形成,促进缺血心肌与肢体的血管新生,达到改善功能与保护肢体的目的。 Lygase Closed Circle Cohesive Ends Linear Double Stranded Opened Circle 血管新生是当前医学与生物学研究的热点,治疗性血管新生在心脏血管与外周血管狭窄的动物实验中有很好的效果,并且已在数百例心与外周动脉缺血患者进行了临床一、二期试验治疗,取得了一定的成绩。 但由于对人有效灌注所需的管腔面积要比实验动物大得多,因此取得理想治疗效果要困难得多。 一些重要的问题尚待进一步解决: ①确定合适的剂量以及更合理地联合运用多种诱导因子? ②延长转染的基因在体内的表达时间? ③是否有使机体其他部位不该增生的血管增生的危险? 治疗性血管新生为心与外周血管疾病的防治开辟了一个新的途径,并可能特别适用于那些不能用药物、介入和/ 或手术治疗,或治疗效果不好的患者。 此外,这种新的治疗方法也可促进创伤愈合与手术伤口愈合,将有广泛的应用前景。 血管内皮生长因子(VEGF) 是一种内皮细胞专一性丝裂原和血管新生强烈的刺激因子。内皮细胞表面的两个酪氨酸激酶受体Flt-1 与Flt-1/ KDR 与VEGF 结合后,传导相应的增殖与迁移信号,使内皮细胞增殖,形成新的毛细血管并重构与稳定。 碱性成纤维细胞生长因子( bFGF) 及其受体FGR2 ,血管生长素1 (Ang-1) 及其受体Tie-1与Tie-2 ,胎盘生长因子( PlGF) ,肝细胞生长因子(HGF) ,血管生成素(angiogenin) 、血小板衍生生长因子(PDGF) 与环氧化酶-2 也是重要的促血管新生因子。这些因子相互协同,并且在细胞分化的不同阶段发挥不同的作用。VEGF 在血管新生的起始与维持阶段都有作用, bFGF 主要参与初期过程,而Ang-1 、PlGF 与PDGF 主要影响血管的成熟与稳定。 Ficoll密度梯度离心法得脐血单个核细胞 MACS法脐血CD34 +单个核细胞分离 细胞培养: 将分离所得CD34 +和CD34 - 单个核细胞分别接种于60 mm培养皿中,加入M-199 培养基, 20% FCS、牛脑提取物作为内皮细胞生长补充,抗生素、生长因子VEGF 30 ng和bFGF 24 ng, 于37 ℃, 5% CO2饱和湿度的孵箱中培养。培养3、7、14 d,显微镜下观察细胞形态和细胞簇形成的情况。 试验中细胞的诱导分化主要采用生长因子为VEGF和bFGF。 bFGF可引起内皮细胞的增生和移行,且还可以与VEGF协同作用,在体外促使内皮细胞分裂成毛细血管样结构,在体内产生血管新生 。 VEGF是血管内皮细胞的有丝分裂原，还能抑制CD34 +前驱细胞中树突状细胞的成熟。VEGF和bFGF的组合在体外明显促进内皮系细胞的生长和分化,内皮系细胞具有优势性地生长。 刚分离的CD34 +和CD34 - 单个核细胞呈圆形,细胞形态小,不均匀地悬浮分布于培养皿底部 CD34 +细胞培养48 h后可见细胞贴壁, 3 d后有明显集落形成 7 d后大量梭形细胞从细胞簇周围开始生长。梭形的细胞出现典型的线样排列结构,相邻的细胞簇之间相互连接形成血管网样结构 CD34 - 单个核细胞单独培养,可见部分贴壁细胞,大部分细胞呈悬浮状,且贴壁细胞主要为圆形,随着培养时间的增加细胞形态逐渐变大,呈现出不规则形态 内皮特异性成分蛋白水平的鉴定　CD34 + 细胞培养14 d后在细胞膜和细胞浆中都有弥漫性棕色出现,呈现出阳性反应。证实了有内皮细胞特异性成分ecNOS和flk21 (KDR)蛋白水平的表达 脐血分离的CD34 + 细胞