代谢工程——PHA详解.ppt

聚羟基脂肪酸的代谢工程机理和应用研究 曹 文 斌 卢 加 贵 黄 兰 李 元 秀 霍 虹 宇 张 家 铭 G P 3 目 录 背景与前言 PHA的生物合成 困难与解决 背景与前言 多聚羟基烷酸（PHAs）以治理白色污染为契机，因其有着与石化塑料相似的理化性质，又能在一定条件下被微生物迅速而彻底地降解，成为一种理想的传统石化塑料替代品。此外，PHA具有良好的生物相容性、降解产物无毒性及表面可修饰性等性质，这便极大地拓展了它的应用范围，使其在医疗与医学组织工程方面也有广阔的应用前景。PHA成为科学家们研究的热点。 背景与前言 关于PHA： 一种高分子聚酯，在微生物细胞，特别是细菌细胞中，在碳源过量而其他营养不足时，作为能源储备物质存在着。 PHA家族中单聚物、共聚物及共混物种类的众多。 具有：1）生物降解性 2）可再生性 3）生物相容性 4）代谢产物无毒性 5）表面可修饰性 背景与前言 聚合物命名： 1）R为甲基时，其聚合物为聚β--羟基丁酸(PHB) 2）R为乙基时，其聚合物为聚β--羟基戊酸(PHV) 3）在一定条件下两种或两种以上的单体还能形成共聚物，其典型代表是3HB和3HV组成的共聚物P(3HB-co-3HV)。 PHAs的物理化学性质： 1）PHB较脆和发硬，但可通过与适量HV共聚而补偿 2）随着PHBV中HV组分的增加，聚合物的劲度降低而韧性增加，且熔点亦降低，使得较易对其进行热加工处理。 3）单体4HB的聚合物或3HB与4HB的共聚物P(3HB-co-4HB)则是高弹体，且其生物降解的速度比均聚PHB或PHBV更快。 PHA的生物合成 Pathway I(a) 这是一种由β-酮硫解酶(phaA编码)和乙酰乙酰辅酶A还原酶(pha B编码)催化合成3-羟基丁酰辅酶A。可具体为三步反应 β-酮硫裂解酶催化乙酰CoA生成乙酰乙酰CoA 在依赖NADPH的乙酰乙酰CoA还原酶的作用下把乙酰乙酰CoA还原成(R)-3-羟基丁酰CoA 单体(R)-3-羟基丁酚CoA由PHA合成酶催化聚合成PHA PHA Pathway I(b) 糖代谢或其他代谢产生乙酰辅酶A β-酮硫裂解酶催化两个乙酰CoA生成乙酰乙酰CoA 在依赖NADPH的乙酰乙酰CoA还原酶的作用下把乙酰乙酰CoA还原成(R)-3-羟基丁酰CoA 单体(R)-3-羟基丁酰CoA由PHA合成酶催化聚合成PHA 依赖NADPH的乙酰乙酰CoA还原酶催化(L)-3羟基丁酸CoA B (L)-3羟基丁酸CoA经过两个立体专一的烯酰辅酶A水合酶先后作用而转变成(R)-3羟基丁酸辅酶A A Pathway II PHA PHAs的合成与脂肪酸氧化途径的中间产物相连。使用其中间产物为碳源来合成PHA 脂肪酸氧化生成酰基CoA 酰基CoA转化成烯酰基CoA 烯酰基CoA在PhaJ（(R)-烯酰基CoA水合酶）催化下生成(R) -3-羟基丁酰CoA 单体(R)-3-羟基丁酰CoA由PHA合成酶催化聚合成PHA Pathway III PHA 这是一条以脂肪酸合成途径的中间产物为底物进行PHAs的合成路径 由糖代谢产生的中间产物为起始，转化至丙二酰基ACP 丙二酰基ACP进入脂肪酸合成反应中，生成中间产物3-酰乙基ACP 3-酰乙基ACP生成(R)-3-羟基丁酰CoA 单体(R)-3-羟基丁酰CoA由PHA合成酶催化聚合成PHA 困 难 难获取高纯度的合成酶 难获取羟基脂肪酸辅酶A 生产成本偏高 改进策略 I 难获取羟基脂肪酸辅酶A SOLVE （R)-3-羟基酰基载体蛋白-辅酶A转酰基酶（Pha G）基因克隆 原 因 1.目前前体供应是合成过程中的瓶颈。 2.提供中长链3-羟基脂肪酸单体的酶使用PhaG更经济 操 作 应用PCR法克隆该基因，并选择pBBRIMCS-2作为起始质粒，构建表达载体H13 分别通过PCR法将PhaC1基因和PhaC基因分别插入表达载体，构成C08和C09 表达载体表达功能的验证以及稳定性验证 新克隆DNA片段的功能验证以及对受体生长的影响 重组质粒导入E.coli，在不同碳源条件下利用PhaG合成羟基脂肪酸的情况与结果 改进策略 I 难获取羟基脂肪酸辅酶A SOLVE 1）根据DNA片段的同源性，分离获得的PhaG基因在重组质粒上，证实为有遗传效应且有表达能力的片段。 小 结 2）异源表达新克隆得到的phaG基因同源DNA片段对菌株的生长没明显影响，且显著提高了菌体中中长链PHA的积累量。 3）利用质粒pLZZGPp在