仪器高效液相色谱法详解.ppt

第三章 高效液相色谱法(HPLC) 液相色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。 由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此，对固定液选择较简单，只需使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题。 它包括脱气、梯度淋洗、温控、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置 。 二、各部分功能简介 1、高压输液系统 包括溶剂贮存器、高压输液泵、梯度洗脱装置和压力表等组成。 （1）溶剂贮存器：由玻璃、不锈钢、聚四氟乙烯 塑料等制成容量1～2 L容器，用于贮存足够 数量、符合要求的流动相。 溶剂使用前要过滤和脱气 溶剂脱气方法 抽真空脱气法、吹氢脱气法 超声波脱气法 加热脱气法 B 对高压输液泵的要求： （2）高压输液泵 A 作用：将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续 不断地送入流路系统，它是HPLC的关键 部件，要求压力：150～450×105 Pa。 。 输出压力高:（150～500）×105 Pa； 流量范围宽: 0.1～ 10 mL/min 内连续可调； 流量恒定，无脉冲； 流量精度和重复性好（0.5%以内）； 耐腐蚀、密封性能好。 恒流泵：在一定操作条件下，输出流动相流量保 持恒定，而与色谱柱引起阻力变化无关； 恒压泵：能保持输出压力恒定，但其流量则随色 谱系统阻力而变化，故保留时间的重现 性差。 它们各有优缺点。目前恒流泵比恒压泵优越，使用较普遍 恒流泵分机械注射泵和机械往复泵两种。 C 高压输液泵类别 2、进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30 cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。 柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。 （1）组成：进样口，注射器，进样阀等。 （2）作用：把分析样品快速、有效地送入色谱柱内。 （3）要求：为获得良好分离效果及分析重现性，需将样 品“浓缩地”瞬间注射到色谱柱顶端, 成为一个样点。 准备状态 进样状态 流动相入口 色谱柱入口 样品出口 样品入口 流动相入口 色谱柱入口 样品环 （4）六通阀进样装置工作示意图 3、分离系统——色谱柱 （1）组成：色谱柱（包括固定相）、柱温控制箱、 连接管。 （2）作用：使被分析物质在色谱柱内分离。 （3）色谱柱 标准柱型：内径 4.6mm，长度15或25 cm，柱管材料有不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。 填料颗粒度：5～10 μm 。 A 溶剂要脱气，溶剂和样品应过滤， 防止堵塞。 B 更换流动相要渐变。 C 用后要清洗。 D 不用时要保存好。 （4）使用色谱柱注意事项： 4、检测系统 （1）作用：将色谱柱流出组分进行检测，并将浓 度或质量信号转变成电信号输出。 （2）要求：A 灵敏度高； B 稳定性好； C 线性范围宽； D 死体积小； E 对流动相流量变化不敏感。 是HPLC中应用最广泛的检测器。它的原理基于待测组分对特定波长的紫外或可见光的选择性吸收，试样浓度与吸光度的关系服从朗伯-比尔定律。 A 紫外光度检测器（UV） 优点：灵敏度高，选择性好，对流量和温度的变化不敏感，适用于梯度淋洗，线性范围宽，适用于痕量分析。最小检测量10-9g·mL-1。 （3）常用的高效液相色谱检测器 缺点：只适用于检测能吸收紫外、可见光的物质，流动相选择受限制。要求流动相在测定波长下无吸收。 B 光电二极管阵列检测器 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。 C 示差折光率检测器 检测器是一种通用型检测器。它的作用原