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体外分析技术 昆明医学院第二临床学院 杨青 副教授 第四章 体外分析技术 本课内容 概 论 第一节放射免疫分析 第二节免疫放射分析法 第三节 其他体外放射分析法 第四节 非放射性标记免疫分析技术 概念 体外分析技术（in vitro assay）是指在体外，即在反应管中对生物活性物质进行超微量分析的技术。 体外放射分析（in vitiro radioassay）是指在体外条件下，以放射性核素(radionuclide)标记的配体（ligand）为示踪剂，以竞争或非竞争性免疫结合反应为基础，以放射性测量为定量手段，对各种微量生物活性物质进行检测的一类核医学检测方法。 发展 免疫结合反应由竞争性免疫结合反应 非竞争性免疫结合反应 放射性核素标记配体的免疫分析 非放射性核素标记配体的免疫分析 体外分析技术的特点为 1、灵敏度高　可测水平10-9～10-20 。 一般化学分析法检出极限为10-3～10-6 2、特异性强　具有良好的特异结合试剂，能识别化学结构上非常相似的物质，甚至能识别立体异构体，例：能识别T3、T4、RT3（T4脱去外环上第5位上的碘---T3，脱去内环上第5位上的碘---RT3）；能准确测定生物活性物质的亚单位浓度。 3、精密度高　反映出来的是随机误差小（统计及实验误差）。 4、应用广泛　以放射免疫分析法为例目前至少有300多种生物活性物质的 (二) 标准曲线 (standard carve)制作方法： 1. 配制一系列已知浓度的标准抗原Ag的反应管，并标明浓度； 2.分别向反应管中加入固定量的*Ag、Ab； 3.经过一定时间的温育竞争结合反应； 4.待竞争结合反应平衡后，分离结合B（Bond）部分和游离F(Free)部分； 5.用放射性探测器测得*Ag-Ab放射性为B或游离*Ag的放射性为F； 6.计算出结合率B%[B/（B+F）×100]，或B/B0%；B0为不含Ag的结合率，因Ag为“0”，故B0 *Ag-Ab的结合率为最大结合率； 7.以B%或B/B0为纵坐标，标准抗原浓度为横坐标，绘制出B%或B/B0随Ag量变化的曲线即为标准曲线（图4-2）。 RIA的必备条件包括由国家批准的生产单位提供的试剂、分离技术、测量仪器。 主要试剂的组成是：特异性抗体(specificantibody)、标记抗原（radionuclide labeled antigen）、标准品（standard）（非标记抗原）。 (一) 特异性抗体(specific antibody) 以被测物质为抗原注入动物体内，一定时间后在动物血清中即可获得能与该抗原特异性结合的抗体，即为特异性抗体，而含有该抗体的血清称为抗血清（anriserum）。 在免疫过程中分子量＞5,000的多肽和蛋白质才能产生抗体， 分子量＜5,000的肽类物质，需要与载体蛋白结合才能产生抗体。 免疫动物产生的抗血清不一定都适合放射免疫分析，需选择亲合力（affinity）大、滴度(titer)高、特异性（specificity）强者使用。 1.亲和力（affinity） 是免疫反应中抗体和抗原之间相互作用的一种结合能力和强度。亲和力大则免疫结合速度快、牢固。亲和力大小以亲和常数Ka值来判断，一般要求在1010～1012L/M之间。 2.抗体的特异性（specificity） 是指抗体分别与相应抗原和抗原结构类似物的结合能力的比较。抗体与抗原结构类似物的结合称为交叉反应（cross reaction），抗体的特异性由此来判断，交叉反应越小越好。 3.抗血清滴度(antiserum titer) 是以免疫反应中所需抗血清（antiserum）稀释度的倒数来表示。稀释倍数越高，滴度也就越高，表示抗体的效价越高。 1.放射性核素标记的抗原（radionuclide labeled antigen，*Ag） 要求高纯度的抗原，其纯度直接影响方法的特异性、准确度及灵敏度。因此尽可能的提纯和纯化。 2.标记抗原的放射性核素　主要用125I和3H标记。临床多用125I标记多肽类激素及蛋白质。3H则标记小分子化合物。 3.对标记抗原的要求 （1）比活度（specific activity）高而适当　比活度是指每微克抗原上标记的放射性核素的千贝克数（kBg/ug）,其直接影响方法的灵敏度。 （2）免疫活性（immune activity）　在标记或是蓄存过程中，可能由于外界条件的变化而造成标记抗原的损伤并使其活性下降,造成与抗体反应的能力减弱甚至丧失。蛋白质分子上标记过多的碘原子也会引起免疫活性的改变， （3）放化纯度(radiochemical purity)　是指具有免疫活性的标记抗原总放射性的百分数，放化纯度应