体外试验与生物新技术在毒理学中的应用详解.ppt

第十二章 体外试验与生物新技术 在毒理学中的应用 内容提要 第一节?? 体外试验 第二节 哺乳动物细胞制备和培养 第三节 分子生物学技术在毒理学中的应用 第一节?? 体外试验 ①全世界每年约有千种以上的新化合物作为商品进入人类的环境。而且在现有的化合物中，还有相当数量没有进行必要的毒理学评价。在此种情况下，利用经典的整体动物试验取得完整的毒理学资料极为困难。解决此种问题的重要方向是体外试验。 ②现有的整体动物毒性试验方法需消耗大量的时间和昂贵的经费，而体外试验则可节省时间和经费。 ③动物保护主义运动的兴起，要求尽量减少动物的使用，而且应当尽量减少痛苦地处理动物。 ④更重要的是由于生物技术的巨大进步，不仅表现在细胞组织及器官培养领域，而且在生物分子技术方面，也为毒性试验和研究提供了新的方法和工具。 所以体外试验在毒理学研究中所占的地位日趋重要，甚至有占主导地位的趋势。 体外试验的发展，并不排斥体内试验本身的重要性，两者必须相互补充、相互验证才能为毒理学研究提供坚实的科学基础。 可依据体外试验在决策过程中所起的作用将其分为3类：①筛选试验。它仅提供决策过程的最初的资料，还需要进行更权威的试验，无论是整体还是体外试验。②附加试验。它可为协作部门或法律部门的最终决策过程提供有用的资料，如机理的研究，但仅有它是不够充分的。③替代试验。它是在大量实验的基础上，使体外毒性试验能替代整体动物试验，以提供更多的信息。 体外试验的基本原理是所观察到的毒理学效应均是毒物和／或反应活性代谢产物在敏感性细胞上或敏感细胞内某一分子靶部位作用的结果。 如将敏感细胞或某分子靶部位例如酶，在体外条件下，维持其正常的生理功能，并观察外源化学物对其的影响，即将毒理学中毒物中毒的启动阶段，在体外条件下，观察其对外源化合物的反应和外源化学物对它的作用。 基于上述原理，体外试验模型取材范围很宽，可取哺乳动物的离体脏器灌流、脏器切片温育、细胞培养、亚细胞器组份以及提纯的某些酶分子或DNA分子等等。 能控制环境因素； 可排除相互作用的系统如免疫系统、神经内分泌系统的影响； 每一剂量水平可利用大量的生物样品，如细胞，细胞器等； 试验间的误差较少； 可同时和／或反复多次取样； 可做成复杂的互相作用的试验系统，如复合细胞培养等； 较为快速和经济； 需要较小量的受试化合物； 产生较小量的有毒废物； 可以利用人体细胞； 减少整体动物的使用。 其中特别值得一提的优点是体外试验的简便和易于利用人体细胞。 体外毒性试验结果可迅速得出，将减少了解新化学物毒理学资料所需的时间，最终可以缩短从新化学物的合成到产品进入市场的时间过程。此外，对鉴定毒理学资料有问题的新化学物，可及时终止开发，减少由资源到产品的投入。 在毒理学整体试验中禁止直接进行人体试验。在体外试验中，利用人体细胞组织进行试验，可较好地解决物种差异的问题。 ①体外到体内外推的问题。 体外试验是依据毒性作用的始发阶段及继续发生的分子与细胞反应，其与整体系统有差异，如何将产生体外毒性的体外浓度与相应体内剂量联系的问题是最终未解决的难题。 它需要更好的工具——预测性毒物代谢动力学来解决，其关键在于发展有生理学基础的毒物代谢动力学模型。 ②体外毒性试验难以预测慢性毒性。 因为，慢性毒性病理过程的机理所知甚少，缺乏发展体外试验的理论依据，再者，某些体外系统仍难以达到长期维持生理状态的要求。 1. 肝脏灌流 是毒理学中研究外源化合物对肝脏损伤及代谢的常见方法。在灌流液中加入外源化学物，此外要维持灌流液的pH值、氧含量，还要控制适宜的灌流液流速。 一般是以下腔静脉和门静脉为插管灌流通路，为此应结扎肝动脉、上腔静脉，在恒温条件下灌流。需指出肝灌流时间不能过久，以4h之内为宜，否则肝细胞的功能与生存不能维持。 2. 肠灌流 利用某一部分小肠体外灌流可以研究一些化合物的吸收及动力学过程。 如用大鼠，则在麻醉下切腹分离一段小肠，在保持原有血液循环体系下，将肠两端插管，清洗净肠中内容物，在恒温环境中灌入灌流液。 3. 膈肌-膈神经标本 取完整的大鼠膈肌-膈神经置于恒温灌流液中，在几小时之内可维持基本正常的神经肌肉传导。 这种标本可用在研究神经毒物对神经传导功能的损伤及强度。 肝脏、肾脏、脑部及心均可以制备切片。例如，脑片和心肌条等是将组织片置于恒温的孵育液中进行有关试验研究，但需注意切片中的细胞需保持完好的细胞基质和细胞之间的交流。