抗菌肽论文抗菌肽OncorhyncinⅡ的克隆及其在毕赤酵母中的表达纯化及抗菌机制研究(精选).doc

抗菌肽论文：抗菌肽OncorhyncinⅡ的克隆及其在毕赤酵母中的表达、纯化及抗菌机制研究 【中文摘要】抗菌肽(Antimicrobial peptide,AMPs)是一类广泛存在于生物体内、在生物遭受外界异物或病原微生物刺激时能快速产生的小分子多肽。研究发现,抗菌肽具有多种生物学活性,它不仅对病原微生物如细菌、真菌、病毒和原虫等具有广谱的杀灭作用,还能抑杀癌变细胞、调节机体免疫等。抗菌肽以其广谱、安全且无耐药等生物学特点,有可能被开发成为一种新型的抗生素来替代传统抗生素在医药、农业和食品等领域应用。本课题的研究对象抗菌肽OncorhyncinⅡ分离自虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)的表皮分泌物中,它是由69个氨基酸残基组成,分子量约为7.2kDa,等电点为12.96,具有较强的稳定性,在微摩尔浓度下便能抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长,而且在发挥抗菌活性的同时并未出现溶血作用。本课题研究借助基因工程技术构建生产来源于虹鳟鱼表皮分泌物中的抗菌肽OncorhyncinⅡ的毕赤酵母生产菌株,并将其发酵后进行分离纯化以获得高纯度的多肽,最后初步探究抗菌肽OncorhyncinⅡ的抗菌机制。1毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体及工程菌株的构建采用RT-PCR的方法从虹鳟鱼的表皮中获得抗菌肽OncorhyncinⅡ的cDNA序列,并将其克隆至载体pGEM(?)-T Easy上,然后测序验证序列的正确性。根据抗菌肽OncorhyncinⅡ的基因序列设计上下游引物,以OncorhyncinⅡ/pGEM(?)-T Easy为模板,进行PCR扩增,以获得片段。将获得的片段和载体分别用限制性内切酶EcoRⅠ和Kpn1进行双酶切,然后用T4DNA连接酶进行连接,最后成功构建出毕赤酵母表达质粒pGAOnⅡ。将重组表达质粒pGAOnⅡ和质粒pGAPZαA经Bln I线性化处理后电击转化入毕赤酵母GS115中,在含有ZeocinTM的YPDS培养基上筛选获得抗性转化子。在含有1000μg/mL ZeocinTM的YPDS培养基上得到高拷贝转化子,经过PCR验证,获得了高拷贝的阳性转化子。将高拷贝的阳性转化子培养后用Tricine-SDS检测多肽的表达,条带与预期的分子量一致,结果表明重组表达的抗菌肽OncorhyncinⅡ成功被分泌至胞外。发酵液上清中的抑菌活性分析表明,重组抗菌肽OncorhyncinⅡ具有一定的抗菌活性,它对革兰氏阳性菌的抑制作用明显强于对革兰氏阴性菌及真菌的抑菌作用。对发酵液上清中抗菌肽OncorhyncinⅡ的稳定性研究表明,抗菌肽OncorhyncinⅡ具有较强的热稳定性,且能耐受反复冻融的处理。2抗菌肽OncorhyncinⅡ的分离纯化及性质研究首先采用阳离子交换树脂SP Sepharose Fast Flow对发酵液中的抗菌肽进行分离纯化,用Tricine-SDS检测,结果发现2号洗脱峰存在多肽OncorhyncinⅡ,且杂蛋白的分子量在1.5kDa以上。第二步选择10kDa的超滤膜分离系统,将分子量较大的杂蛋白截留,而小于10kDa的多肽和大部分盐分被滤出。将截留液和滤出液进行Tricine-SDS检测,结果与预期相同,多肽被保留于滤出液中。最后用1kDa的透析袋透析脱盐,冻干后得到抗菌肽OncorhyncinⅡ纯品。高纯度的抗菌肽OncorhyncinⅡ仍然具有明显的抑菌作用,对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.54μg/L。3抗菌肽OncorhyncinⅡ的抗菌机制研究选用金黄色葡萄球菌最为受试菌株,首先研究抗菌肽OncorhyncinⅡ的抑菌动力学。观察抗菌肽OncorhyncinⅡ对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响,结果发现OncorhyncinⅡ对金黄色葡萄球菌的抑制作用迅速、高效,且与作用时间呈正相关。观察抗菌肽OncorhyncinⅡ对金黄色葡萄球菌细胞通透性的影响,结果表明抗菌肽可导致细菌细胞的通透性增强,可能以菌体内容物泄露的方式导致细菌的死亡。其次采用活细胞工作站和透射电镜技术观察抗菌肽OncorhyncinⅡ作用于金黄色葡萄球菌的形态变化。本研究取得的主要研究成果有：1.成功构建了抗菌肽OncorhyncinⅡ毕赤酵母分泌表达质粒pGAOnⅡ并采用毕赤酵母表达系统对OncorhyncinⅡ进行分泌表达,获得了具有抗菌活性强、稳定性好的重组表达产物。2.成功建立重组抗菌肽OncorhyncinⅡ的分离纯化工艺,最终获得了纯度较高、活性和稳定性较好的抗菌肽OncorhyncinⅡ。3.初步探究了抗菌肽OncorhyncinⅡ的抗菌肽机制。本研究为抗菌肽OncorhyncinⅡ在医药、农业及食品等领域的研究和开发奠定了一定的基础。 【英文摘要】Antimicrobial