7蛋白浓度的测定201410.10.ppt

蛋白浓度的测定 蛋白浓度测定的方法 物理方法：紫外分光光度法 化学性质：凯式定氮法，双缩尿法，Lowry法，BCA法，胶体金法 染色性质：考马氏亮蓝染色法，银染法 其他性质：荧光法 ? 蛋白浓度的直接测定（UV法） 这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。. 比色法蛋白浓度测定 蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。 一、双缩脲法双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法，至今仍广泛采用。在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1N NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。 二、Lowry法　　此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即Cu++与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L～400mg/L含量的蛋白质溶液。其干扰物质与双缩脲法相同，要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上述提到的还原反应只有在pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络合物所还原。 三、BCA（Bicinchoninine　acid　assay）法  这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2+反应产生Cu+，后者与BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系极强，反应后形成的化合物非常稳定。相对于Lowry法，操作简单，敏感度高。但是与Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂干扰。 ? 试剂盒成份： 1.???试剂 A：　BCA试剂 2.?? 试剂 B：　Cu试剂 3. BSA标准： 4mg/ml 标准曲线制备及待测样本的浓度测定 1.标准蛋白稀释 管号 2# 3# 4# 5# 6# 7# 8# BSA(ul) 30 H2O(ul) 30 30 30 30 30 30 30 混匀，取30微升置前 一个管中，将前一个管 混匀后取30微升再向前 ，依此类推。 2.待测样本稀释 管号 1X 2X 3X H2O 30 30 30 待测标本 30 30 30 各自混匀 3.转板： 10ulH20 10ulH20 10ul1X 10ul1X 10ul2# 10ul2# 10ul2X 10ul2X 10ul3# 10ul3# 10ul3X 10ul3X 10ul4# 10ul4# 10ul5# 10ul5# 10ul6# 10ul6# 10ul7# 10ul7# 10ul8# 10ul8# 工作液配制： 4. 在1支15毫升的离心管中先取4800微升的BCA试剂，再取98微升的Cu试剂，混匀，在酶标板相应的孔各自加入200微升，轻轻混匀。 5. 置37℃温箱中30分钟 6. 保温结束后，在酶标仪上读取OD值， 条件：562nm 计算结果 将得到的OD值通过Excel表做出蛋白标准曲线。 通过标准曲线算出待测标本的浓度。