9-2目的基因的克隆.ppt

第五章 目的基因的分离克隆 基本概念 目的基因分离克隆的方法概述 基因文库技术分离目的基因 功能蛋白组技术分离目的基因 mRNA差别显示技术分离差别表达基因 插入突变分离克隆目的基因 酵母双杂交系统分离克隆目的基因 四、功能蛋白组技术分离目的基因 4.1基本概念：蛋白质组和功能蛋白质组 4.2蛋白质双向电泳技术 4.3功能蛋白氨基酸序列分析 4.4功能蛋白基因分离 蛋白质组是指“由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质”。 功能蛋白质组是指那些可能涉及到特定功能机理的蛋白质群体。这群体可大可小，与特定功能及研究方法、手段及具体实验设计有关。各功能蛋白组的组合可描绘出生命细胞大致的蛋白组图谱。 4.2 蛋白质双向电泳技术 4.2.1 双向电泳原理 4.2.2 用于功能蛋白组研究的双向电泳系统 4.2.3 功能蛋白组双向电泳技术说明 蛋白质双向电泳技术 4.2.1 双向电泳原理：双向电泳是由两个单向电泳组合而成，在第一向电泳后再在与第一向垂直的方向上进行第二向电泳。双向电泳分离原理与组成它的两个单向电泳的分离原理基本相同。要获得良好分离效果，两个单向电泳的分离依据要有很大不同。 目前常用的单向电泳极其分离依据 PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳） SDS（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳） PG（孔径梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳） IEF（等电聚焦-聚丙烯酰胺凝胶电泳） PAGE:依据电荷多少及分子大小。 SDS：由于在凝胶及缓冲液中加入阴离子表面活性剂SDS及巯基乙醇，蛋白质拆分成亚基并与大量SDS结合，各组分间原有的电荷差异被消除，仅按分子大小分离。 PG:蛋白质在电场作用下沿凝胶浓度逐渐增高，孔径减小的方向泳动。电泳初期各组分迁移速度取决于电荷多少及分子大小。当各组分迁移至凝胶孔径阻力足以停止其泳动时，电荷差异不再起作用，各组分的最终迁移位置仅由其分子大小决定。 IEF: 等电聚焦法是一种特殊的聚丙烯酰胺凝胶电泳法。它的特点是在凝胶柱中加入两性电解质载体 -Ampholine，从而使凝胶柱上产生pH梯度。当向两性载体凝胶施加电场时，即可形成pH梯度，pH梯度的顺序是从阳极到阴极pH值逐渐增大。 蛋白质为两性电解质，其所带电荷的性质和数量随所处环境的pH而变化。当蛋白质在等电聚焦凝胶柱中进行电泳时，带电荷的蛋白质离子即在凝胶柱上泳动：带负电荷的蛋白质分子向阳极移动，带正电荷的蛋白质分子向阴极移动。当蛋白质样品泳动到凝胶的某一部位，这一部位的pH值正好相当于该蛋白质的等电点时，蛋白质的净电荷为零不再移动，则聚焦形成一条蛋白质区带。这种按等电点的大小在pH梯度某一相应位置进行聚焦的方法称为等电聚焦。 4.2.2 用于功能蛋白组研究的双向电泳系统 IEF/SDS（ISO-DALT） IPG-DALT IEF/PG微型双向电泳系统 IEF/SDS（ISO-DALT） 1975年O′Farrall等人根据不同组份之间的等电点差异和分子量差异建立了IEF/SD S双向电泳。其中IEF电泳（管柱状）为第一向，SDS为第二向（平板）。在进行第一向IEF电泳时，电泳体系中应加入高浓度尿素、适量非离子型去污剂NP-40。蛋白质样品中除含有这两种物质外还应有二硫苏糖醇以促使蛋白质变性和肽链舒展。 目前认为采用该系统可以分离5000个不同的蛋白质组分。其分辨率之高是其它电泳系统不及的。 IPG-DALT 该系统是对IEF/SDS电泳系统的改进，第一向电泳采用了固相pH梯度等电聚焦。IPG-DALT具有分辨率高，重复性好，信息量大的优点。IPG胶梯度范围大，电内渗作用弱，对碱性蛋白如核糖体蛋白有很好的分离效果。IPG-DALT系统经过十几年的发展，已进行了较大改进，如分离极碱性蛋白的IPG胶其pH可达12; 可应用极窄pH胶条提高分辨率; 已有商业化的IPG胶条出售等。 IEF/PG微型双向电泳系统 在IEF/PG的基础上，近來发展了一种微型IEF/PG双向电泳，第一向IEF是在內径为1.3 mm、长度42 mm的毛细管中制胶与电泳，第二向是在50x38 mm的微型胶板上进行电泳。其原理与IEF/PG完全相同。微型IEF/PG与IEF/SDS比较，有以下3个特点： 微量、快速。样品体积仅需1-2μl，相当于50-150μg蛋白质，电泳时间从一般的十几到几十小时缩短为三小时左右即可完成。 样品耗损小，因省略了第一向电泳与第二向电泳之间凝胶条的平衡步骤，存在于凝胶条中的蛋白质成分不会损耗。 保持了蛋白质天然构象与活性，在这两向电泳体系中，不含蛋白质变性剂，因而有利于蛋白质活性检测。 4.2.3 功能蛋白组双向电泳技术说明 样品制备 蛋白质上样量 第一向等电聚焦电泳条件 平衡 第二向电泳的样品胶处置 图谱检出 4.3功能蛋