1.1DNA重组技术的基本工具(黄).ppt

资料分析 此转基因实验实现了哪种生物的哪些性状在另外哪种生物中表达？ 性状的表达与我们从前学过的什么过程有关？ 要实现药物基因在烟草中的表达，要提前做哪些关键工作? 限制酶在原核生物中的作用 原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。 含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 磷酸二酯键 限制性内切酶 限制酶所识别的序列有什么特点 限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。 2和7能连接形成…ACGT… ????????????? …TGCA…； 4和8能连接形成…GAATTC… ???????????? …CTTAAG…； 3和6能连接形成…GCGC… ???????????? …CGCG…； 1和5能连接形成…CTGCAG… ???????????? …GACGTC…。 连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为E·coli连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。 这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA。 E·coli连接酶只能连接黏性末端； T4连接酶既可“缝合”黏性末端，又可“缝合”平末端。 DNA连接酶——“分子缝合针” DNA连接酶与DNA聚合酶一样吗？为什么？ 基因的载体——“分子运输车” 二、DNA连接酶——“分子缝合针” DNA连接酶连接黏性末端之间的磷酸二酯键，形成重组的DNA分子。 DNA连接酶 DNA聚合酶 连接DNA链 双链 单链 连接部位 在两DNA片段之间形成磷酸二酯键 将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3’末端的羟基上，形成磷酸二酯键 基因进入受体细胞的载体 　　 要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去！能将外源基因送入细胞的工具就是载体。 运载体： 常用主要有两类： 1）细菌的质粒(绝大多数是环状DNA分子) 2）噬菌体或某些动植物病毒 三、基因进入受体细胞的载体 —“分子运输车” 基因进入受体细胞的载体 假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？ 作为载体没有切割位点将怎样？ 目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？ 如果载体对受体细胞有害将怎样？ 基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒，即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？其实不然，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件。 （1） 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。 （2） 载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。 （3） 载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。 （4） 载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。 （5） 载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。 实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。 作为载体的必要条件 能自我复制 有切割位点 能与目的基因结合 能进入受体生物细胞并在受体生物细胞内复制并表达； 有遗传标记基因 对受体细胞无害 比较容易得到 3、基因的运输工具——运载体 能复制并带着插入的目的基因一起复制 有切割位点 有标记基因的存在，将来可用含青霉素的培养基鉴别。 运载体的作用有哪些？ 一：将外源基因转移到受体细胞中。 二：利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行复制。 载体必须具备的条件： 1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存； 2、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接； 3、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等 ） 4、对受体细胞无害 载体的作用： 1、将外