维生素的荧光光度法测定(精选).doc

实验题目：教学目标： VB2的基本原理和方法 2．熟悉荧光分光光度计的结构及使用方法。 教学重点： 掌握教学难点： 了解仪器药品： 教学方法： 讲授、演示教学时数： 学时 教学过程： 一、实验原理 既然激发谱是表示某种荧光物质在不同波长的激发光作用下所测得的同一波长下荧光强度的变化，而荧光的产生又与吸收有关，因此激发谱和吸收谱极为相似，呈正相关关系。 由于激发态和基态有相似的振动能级分布，而且从基态的最低振动能级跃迁到第一电子激发态各振动能级的几率与由第一电子激发态的最低振动能级跃迁到基态各振动能级的几率也相近，因此吸收谱与发射谱呈镜象对称关系。 对同一物质而言，若abc＜＜1（＜0.05或0.03），即对很稀的溶液，荧光强度F与该物质的浓度c有以下的关系： F 2.303Фf I0 a b c 式中：Фf　－荧光过程的量子效率；I0－入射光强度；a－荧光分子的吸收系数；b－试液的吸收光程。I0 和b不变时： F＝KC 式中K为常数。因此，在低浓度的情况下，荧光物质的荧光强度与浓度呈线性关系。 VB2 即核黄素 在430～440 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为525 nm。VB2的荧光在pH 6～7时最强，在pH 11时消失。 二、实验步骤 1．标准系列溶液的配制 在五个干净的50mL容量瓶中，分别加入1.00 mL，2.00 mL，3.00 mL，4.00 mL和5.00 mL VB2标准溶液，用H2O稀释至刻度，摇匀。 2．标准溶液的测定 设置适当的仪器参数 如Data Mode Fluorescence， 激发波长 435 nm，发射波长 525 nm ，用蒸馏水作空白，清零。然后，从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。 3．未知试样的测定 取待测液2.50 mL置于50mL容量瓶中，用H2O稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，测量其荧光强度。 三、数据处理 项目 参比液0 1 2 3 4 5 待测液6 经稀释 加入VB2标准溶液体积/mL － 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 － 加入VB2待测液体积/mL － － － － － － 2.50 用H2O稀释定容，摇匀，测定 … … … … … … … ρ VB2 /mg·L-1 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 0.470 荧光强度 F 0 45.055 83.859 125.935 166.844 210.027 98.761 1．用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线如图1。 2．根据经稀释的待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度ρ VB2 0.470 mg·L-1， 则原待测液的浓度ρ VB2 0.470 mg·L-1 × 9.40 mg·L-1。 由上可知，药片中VB2含量为9.40 mg·片-1。 四、思考题 1、荧光分光光度分析的原理是什么？ 2、如何对进行定量分析？ 五、教学后记 每次VB2标液最好现配，或做工作曲线时重配，以防光解。 仪器分析实验 教案