同济大学基因工程3-10章总结.docx

基因工程总结第三章基因克隆的酶学基础限制性核酸内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。Ⅱ型核酸内切限制酶的基本特性：（i）识别特异性序列；（ii）2个单链断裂部位在DNA分子上通常不是彼此直接相对的；（iii）断裂形成的DNA片断，也往往具有互补的单链延伸末端。酶切位点：绝大多数的Ⅱ型核酸内切限制酶，都能够识别由4～8个核苷酸组成的特定的碱基序列，它们双重旋转对称 (回文结构)。即为酶切位点。粘性末端，是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构。它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。具平末端的DNA片段则不易于重新环化。同裂酶（Isoschizomers）：来源不同，识别的是同样的核苷酸靶子序列。同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。同尾酶（Isocaudamer）：来源各异，识别的靶子序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端。核酸内切限制酶的命名法名称字母来源含义EEscherichia（属）cocoli（种）RRY13（品系）I首先发现在此类细菌中发现的顺序影响核酸内切限制酶活性的因素DNA的纯度DNA的甲基化程度酶切消化反应的温度DNA的分子结构核酸内切限制酶的缓冲液DNA连接酶（ligase）：在一条DNA链的3′末端具有一个游离的羟基（-OH），和在另一条DNA链的5′-末端具有一个磷酸基团（-P）的情况下，能够催化在两条DNA链之间形成的磷酸二酯键。作用方式：DNA连接酶是封闭双螺旋DNA骨架上的缺口（nick），即在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂；而不能封闭裂口（gap），即在双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链断裂。连接酶有两种不同的来源：一种是由于大肠杆菌染色体编码的叫做DNA连接酶，另一种是由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的叫做T4 DNA连接酶（可以催化平端连结）。前者用NAD+作能源辅助因子，后者用ATP作能源辅助因子。作用的分子反应过程可分三步：NAD 或ATP将其腺苷酰基转移到DNA连接酶的一个赖氨酸残基的ε─氨基上形成共价的酶-腺苷酸中间物，同时释放出烟酰胺单核苷酸(NMN)或焦磷酸。将酶-腺苷酸中间物上的腺苷酰基再转移到DNA的5-磷酸基端，形成一个焦磷酰衍生物，即DNA-腺苷酸;这个被激活的5‘-磷酰基端可以和DNA的3’-OH端反应合成磷酸二酯键（连结），同时释放出AMP。平末端DNA片段的连接：常用的平末端DNA片段连接法，主要有同聚物加尾法、衔接物连接法及接头连接法。末端脱氧核苷酸转移酶：它能够将核苷酸加到DNA分子单链延伸末端的3′-OH基团上。热稳定的DNA连接酶（thermostable DNA ligase），是从嗜热高温放线菌（Thermoactinomycesthermophilus）菌株中分离纯化的，一种能够在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接作用的一种核酸酶。DNA聚合酶的共同特点在于，它们都能够把脱氧核糖核苷酸(dNTP)连续地加到双链DNA分子引物链的3′-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况PolⅠ酶有三种不同的酶催活性：5′→ 3′的聚合酶活性5′→3′的核酸外切酶活性(仅仅限于匹配的双链) 3′→5′的核酸外切酶活性（单、双链均可，发生聚合酶活性的时候，3′→5′的核酸外切酶活性是受抑制的）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段（E.coli DNA PolⅠKlenow fragment），又叫做Klenow聚合酶或Klenow大片段酶。主要用途为：（i）修补经限制酶消化的DNA所形成的3′隐蔽末端；（ii）标记DNA片段的末端；（iii）cDNA克隆中的第二链cDNA的合成；（iv）DNA序列测定。末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase， TdT ），简称末端转移酶，具有5′→ 3′方向的聚合作用，不需要模板的存在就可以将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3′-OH末端。末端脱氧核苷酸转移酶的其它应用催化[a-32P]-3’-脱氧核苷酸标记目的DNA片段的3’-末端。这种修饰过的核苷酸由于没有3’-OH，故使得目的片段会终止延伸催化非放射性的标记物掺入到目的DNA片段的3’-末端。例如生物素-11-dUTP等按照模板合成多聚脱氧核苷酸的同聚物。多核苷酸激酶（polynucleotide kinase）催化γ-磷酸从ATP分子转移给DNA或RNA分子的5′-OH末端，当使用γ-32P标记的ATP作前体物时，可以实现目的序列的同位素标记碱性磷酸酶：催化核酸分子脱掉5′磷酸基团，从而使DNA（或