第十章 物理作图.ppt

1. 限制性作图 它是将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置. 其只能应用于较小的DNA分子,其上限取决于作图分子中限制酶位点的频率. 通常采用的6碱基对识别顺序的限制酶仅适合50Kb以下DNA分子的精确作图. 方法： ①用两种限制酶中的—种对DNA分子进行消化，产生片段的大小通过琼脂糖凝放电泳来检测。 ②第二种酶消化DNA分子，再用琼脂糖凝胶电泳检测片段大小。这些结果可以使我们弄清每种酶的限制位点数目，但切点之间的相对位置还不能确定。 ③将DNA分子用两种酶同时进行切割可以获得更多的信息。 ④作部分限制性酶解。这样会产生—套更复杂的产物，除了完全消化的，还含部分消化产物。通过测定一个不完全消化片段的大小，构造出正 确的图谱。 缺点 通常，部分限制酶消化为构建完整的图谱提供了必需的信息。如果有多个限制位点集中、这种分析方法就显得笨拙，因为要考虑的不同片段太多。 改进方法： 在部分消化前将放射性或其他类型的标记物加到要分析的DNA分子两端，结果很多部分限制酶消化产物成为不可见的，因为它们不含有末端片段，因此在琼脂糖凝胶上对标记物进行筛选时不会显现。我们可以利用“可见的”部分限制片段的大小，确定出那些未定位的切点与DNA分子末端的相对位置。 限制因素 1.酶切位点的数目 2.限制酶作图的规模受限于限制片段的大小 50KB 1.2 限制酶作图的改进 脉冲凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis) 稀有切点限制图绘制 具有7个或8个核等酸识别序列的酶4096bp，16384BP，65536bp 识别序列包含靶DNA中稀少基序的酶基因组明显缺少某些基序：例如，人类基因组中5‘GC3’序列很稀少，这是因为人类细胞中含有一种酶，能够向这一序列中的胞嘧啶核苷的5位碳原于添加甲基基团，产生的5甲基胞嘧啶不稳定．容易脱氨基产生胸腺嘧啶。 Sma I 5‘CCCGGG 78ｋｂ ＢｓｓＨ　ＩＩ：5’ GCGCGC　3：390 kb频 ＮｏｔＩ：5‘GCCCGGCCGC3’　平均约每10Mb才有一个位点。 稀有切点限制图绘制注意事项: 识别顺序越长产生的片段越大; 识别位点碱基的组成影响限制性片段的大小; 如人类基因组A/T比例接近60/%,选用高比例A/T位点限制酶,产生的片段多于高比例G/C识别位点酶 有些限制酶识别位点较长 如酵母的Ⅰ-Sce识别顺序为18bp, 如果高等真核生物基因组中无此序列,可通过转座子转座和噬菌体转导的方法将其引入代测基因组中. 基因组DNA 的甲基化状态 如人类活细胞基因组中大量5’-CG-3’顺序的胞嘧啶被甲基化,使许多含有5’-CG-3’顺序的内切酶很少找到可切位点. 2.2 重叠群组建 重叠群:相互重叠的DNA片段组成的物理图. 重叠群的组建方法 染色体步移法 指纹作图法 指纹:系指确定DNA样品所具有的DNA片段; 一个克隆的指纹表示了该克隆所具有的限定的顺序特征. 常用的指纹分析方法: A 限制性带型(restriction patterns)指纹 B 重复顺序DNA指纹(repetitive DNA fingerprints) C STS目录作图(STS content mapping) D 重复DNA PCR(repetitive DNA PCR)或分散重 复顺序PCR(interspersed repeat element PCR, IRE- PCR)指纹 4.1 STS作图原理 条件 独一的STS DNA片段群 4.2 寻找STS的方法: 表达顺序标签(expressed sequence tag，EST) 从cDNA中找到的小段顺序, 但基因家族成员间共有的序列不能用于STS。 SSLP（simple sequence length polymorphisrns，SSLPs） 随机基因组顺序 4.3 用于STS 作图的DNA片段 STS作图过程中所必需的第一个要素是可能获得研究的染色体或基因组的DNA片段群，这样的片段群有时也称为作图试剂 方法：放射杂交体和克隆文库放射杂交体是指合有其他生物体染色体片段的啮齿类动物细胞 4.3 STS的物理图定位 辐射杂种 克隆作图 本章主要内容： 物理作图法 常用物理作图法有那几种 常用的指纹分析方法有哪些，它们的分析机理是什么 序标位作图如何作图 * * 第十章 物理作图(physical mapping)