现代微生物学实验指导分析.doc

实验一、微生物学基础实验 实验1. 鞭毛染色法及活菌活动性暗视野显微镜观察 【目的要求】 1．了解细菌鞭毛染色的原理，掌握鞭毛染色的方法，并了解鞭毛的形态特征。 2．学习暗视野显微镜操作技术。 【实验器材】 菌种：枯草芽孢杆菌1~2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，铜绿假单细胞菌1~2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。 溶液和试剂：硝酸银染色液、香柏油、二甲苯、0.01％美兰水溶液。 仪器和其他用品：酒精灯，载玻片，盖玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，小试管，烧杯，试管架，镊子等。 【基本原理】 细菌的鞭毛极纤细，直径一般为0.1-0.2um，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。 鞭毛染色的基本原理是：在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。 采用鞭毛染色法虽能观察到鞭毛的形态、着生位置和数目，但此法既费时又麻烦。如果仅须了解某菌是否有鞭毛，可采用悬滴法或压滴法直接在光学显微镜下检查活细菌是否具有运动能力，以此来判断细菌是否有鞭毛。此法较快速、简便。压滴法是将菌液滴在普通的载玻片上，然后盖上盖玻片，置于显微镜下观察。 暗视野显微镜又叫暗场显微镜，是一种通过观察样品受侧向光照射时所产生的散射光来分辨样品细节的特殊显微镜。暗视野显微镜和一般的明视野显微镜区别在于二者的聚光器不同，暗视野显微镜装有一个中央遮暗的聚光器，使光线不能通过聚光器，而只能从聚光器四周边及未遮暗的部位斜射到载玻片的标本上。因光线是斜射的，不能进入物镜，故观察的视野是暗的，而聚光器斜射到菌体上的光线，因光散射作用而使菌体发出亮光，反射到物镜内，这样在显微镜中可见到暗视野中明亮的物像。暗视野显微镜主要用于检查未染色标本的形态和运动能力。 【操作步骤】 1．鞭毛染色（硝酸银染色法） （1）载玻片制备：将载玻片用洗涤剂清洗干净，置于95%乙醇中浸泡5min，使用时用镊子取出在火焰上烧去乙醇及可能残留的油迹。 （2）制片：在载玻片一端滴一滴清水，用接种环从斜面培养物种蘸一两下，再在清水中蘸一两下，然后倾斜玻片，使液体缓慢流向载玻片另一端，用吸水纸洗去多余液体，自然干燥。 （3）染色：滴加硝酸银染液A液覆盖菌面3~5min后用蒸馏水充分洗去A液。用硝酸银染液B液洗去残留水分后，再滴加B液覆盖菌面40~50秒，其间可用微火加热，当菌面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗，自然干燥。 2、运动观察 （1）使用研究用暗视野显微镜，或将普通光学显微镜上的聚光器取下，换上暗场聚光器。 （2）不论是使用干燥物镜还是油浸物镜，镜检时都应在聚光器的上透镜上加一大滴香柏油。 （3）将制作好的细菌悬滴标本片置于载物台上，上升聚光器至顶部使油与载玻片接触。 （4）放大光源 。 （4）进行聚光器光轴调节及调焦。用10*物镜找到被检物像，关小聚光器虹彩光圈至可在视野中看到视场光阑的轮廓，再上下缓慢调整聚光器，这样会使视场光阑的像变得清晰，如视场光阑不在场中央，利用聚光器外侧 的两个调节钮进行调整，当亮光点调到场中央后，再将其开大，即可进行观察。 实验2. 荧光原位杂交技术 【目的要求】 通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用。 掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法 【基本原理】 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH)是一个很重要的生物学实验技术，它的特点是原位，无需经过PCR，可以用于对环境样品中特定的微生物进行定量分析。下面是以活性污泥为例的FISH实验步骤及方法。非生物学专业的同学请不要往下看了。 【实验器材】 Y染色体探针、人外周血中期染色体细胞标本、恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻片、Nikon E-400、荧光显微镜、盖玻片、封口膜、200μL移液器、20μL移液器、暗盒、指甲油、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、吐温20。 【操作步骤】 1 载玻片涂层处理 (1) 将载玻片置于盐酸乙醇溶液（1%HCl in 70% Ethanol）中清洗 (2) 晾干后放入poly-L-lysine(0.01%)溶液中5分钟 (3) 放入60℃烘箱60分钟烘干或者放在室温过夜晾干 2样品固定（Sample fixation） (1) 在样品（活性污泥）中加入3倍体积的4% 多聚甲醛，置于4℃冰箱固定3小时以上或者过夜 (2) 离心，弃去多聚甲醛，加入相同体积的PBS (3) 离心，弃去PBS，加入相同体积的乙醇+PBS(w/w 1:1) (4) 固定后的样品放入-20℃冰箱保存。 3 脱水