限制性内切酶_第二章_1_Jun分析.ppt

2.提高限制性内切核酸酶对 低浓低纯度DNA制剂反应效率的方法 ① 纯化DNA； ② 增加核酸内切酶的用量，平均每微克底 物DNA可高达10单位甚至更多些； ③ 扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑 制因素被响应地稀释； ④ 延长酶催化反应的保温时间。 ? DNA的甲基化 1. 原核生物的限制-修饰系统的组成成分是： 甲基化酶：对自身DNA起修饰作用，从而使限 制性内切核酸酶不能识别，保护自 身DNA免受降解。 限制性内切核酸酶：破坏入侵的外源DNA，防御异源遗传信息进入体内。 因此，甲基化作用直接影响限制性内切核酸酶的活性 ? 大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等。而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法： ① 选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响； ? DNA的甲基化 ? 解除限制修饰作用的方法： ② 利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E. coli JM110和链霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲除，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。 ? DNA的甲基化 ? 酶切反应的温度 DNA酶切反应的温度是影响限制性内切核酸酶活性的另一个重要因素。不同的核酸内切酶，具有不同的最适温度，而且彼此之间有很大的变动范围。 但是大多数限制性核酸内切酶的标准反应温度都是37℃。 酶 反应温度（℃） ApaⅠ BanⅠ BstEⅡ MaeⅠ MaeⅡ MaeⅢ SmaⅠ TaqⅠ 30 50 60 45 50 55 25 65 部分限制性内切核酸酶的最适反应温度 ? DNA分子结构 DNA分子的不同的构型对限制性内切核酸酶的活性也有很大的影响。 某些核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA或病 毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA高 出许多倍，最高的可达20倍。 DNA末端长度对限制酶切割的影响: 限制酶切割 DNA 时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求，也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。 ? DNA分子结构 近末端的切割： eg: AccI GGTCGACC? 切不动 CGGTCGACCG 切不动  CCGGTCGACCGG 切不动 eg: EcoRI GGAATTCC CGGAATTCCG  2小时内90%完全酶切 eg: PmeI GTTTAAAC 20小时不能切 GGTTTAAACC 20小时，25%切开 GGGTTTAAACCC 20小时，50%切开 AGCTTTGTTTAAACGGCGGCCGG 20小时， 90%切开 位点偏爱（Site preference） 某些限制酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。 λ 噬菌体 DNA全长48,502bp，有5个EcoRⅠ酶切位点。切割时并非在 5 个位点随机进行，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快 10 倍。 ? DNA分子结构 一般来说，一种限制性内切核酸酶对其不同识别 位点切割速率的差别最多不会超过10倍。 造成位点偏爱现象的原因 限制酶在切割DNA之前需要同时与两个识别位点作用； 限制酶对要求作用的DNA序列有两个明显不同的结合位点，其中一个是为DNA切割时激活另一个的变构位点。 ? DNA分子结构 ? 限制性核酸内切酶的反应缓冲液 1. 缓冲液的主要成分 Tris-Cl：使反应混合物的pH恒定在酶活性所要 求的最佳数值范围内。对绝大数限制 酶来说，最佳pH = 7.4。 MgCl2： 保证酶活性的正常发挥。 NaCl 或 KCl：同上。 35 β-巯基乙醇：防止限制酶的氧化，保持酶的稳定性 （但也可能有利于潜在污染杂质的稳定 性）。 牛血清白蛋白（BSA）：对某些限制酶是必需的，它 是一种中性蛋白，可防止酶在低浓度 蛋白质溶液中变性。 ?