实验二乙肝鉴定精读.pptx

免疫学技术Immunological Techniques 乙肝表面抗原检验 2012级本科讲义?实验二 一、背景知识Background knowledge 抗原-抗体反应特点 特异性 可逆性 浓度适宜 两个阶段 抗原-抗体结合 免疫复合体形成 影响抗原抗体反应的因素Factors affecting the antigen-antibody reaction 离子强度 温度 酸碱度 浓度 抗体的制备Antibody production 抗血清 单克隆抗体 基因工程抗体 单克隆抗体的制备Preparation of monoclonal antibodies SARS H5N1流感 狂犬病 埃博拉出血热 毒蛇咬伤 Q：为什么在今天，血清疗法依然非常有价值？ 人源化抗体的合成Production of human or humanized antibodies 基于抗体的免疫检测技术The use of antibodies in immunoassays 基于免疫复合体 Immune complexes 凝集反应、免疫沉淀 血凝抑制、免疫印迹 基于抗原抗体对 Antibody–antigen pair 免疫标记技术 蛋白质芯片技术 血凝抑制检验The hemagglutination inhibition assay 可用于检验流感，麻疹等病毒 可进行定量检测，不会引起病毒扩增 免疫印迹Western blot （Immunoblotting） 免疫沉淀Immunoprecipitation (IP) 抗原抗体复合物与G/A蛋白结合后形成沉淀而析出 IP免疫印记IP-Western Blotting 先用免疫沉淀法纯化样本 再用免疫印迹法分离样本 最后用免疫荧光技术测定样本 放射免疫技术Radioimmunoassay (RIA) 竞争抑制 Competitive inhibition 免疫荧光技术Immunofluorescence techniques Q:对过敏性紫癜HSP患者的组织切片进行免疫荧光技术检验，可见皮肤血管壁荧光强烈。这是为什么？ 酶联免疫技术的发展Development Of An Enzyme-Linked. Immunosorbent Assay (ELISA) 放射免疫技术1960年 免疫荧光技术1941年 酶联免疫技术1971年 多路阵列技术2007年 等离子增强ELISA技术 （使用纳米技术，等离子表面共振技术） 2012年10月 间接法Indirect ELISA 包被待测抗原，封闭 加入一抗，冲洗 加入二抗，冲洗 加入显色剂，显色 检验包被能力差的抗原时结果存在偏差 二抗及显色部分可通用，成本较低 夹心法Sandwich ELISA 包被特异一抗，封闭 加入抗原，冲洗 加入酶标抗体，冲洗 加入显色剂，显色 检验小分子抗原时受表位空间限制结果存在偏差 仅需较少数量的抗原，灵敏度高 竞争法Competitive ELISA 用抗体孵育待测抗原 包被样本抗原，封闭 加入抗原抗体复合物，冲洗 加入二抗，冲洗 加入显色剂，显色 价格稍贵 适合检验极少数量的待测抗原，灵敏度高。可酶联抗体或抗原。 ELISA技术的应用Applications of ELISA 蛋白定量分析 检验过敏源 检验特异性抗体 检验病毒抗原 常见检测例： 乙肝两对半 结核分歧杆菌抗体 HIV抗体 实验二 乙肝表面抗原检验Hepatitis B Surface Antigen (HBsAg) Assays 二、实验目的The purpose of this experiment 掌握ELISA双抗体夹心法的原理 利用ELISA检测试剂盒对乙型肝炎病毒表面抗原进行诊断。 三、实验原理The experiments principles 待检样本中的抗原与载体上的特异性抗体结合后，可继续结合酶标抗体。加入底物时，底物被酶分解成有色产物。 结合的酶量与样本中抗原的量成正比，有色产物的量与酶量成比例，所以有色产物的量与样本中抗原的量直接相关 四、实验步骤 The experimental method 1.材料与试剂 Materials and reagents 蒸馏水、一次性手套、移液器和无菌吸头、干净的吸水纸、37℃恒温箱 乙肝病毒表面抗体诊断试剂盒：预包被反应板1块，酶结合物1瓶，阳性对照1 瓶，阴性对照1 瓶，浓缩洗涤液1 瓶，显色剂A 1 瓶，显色剂B 1 瓶，终止液1 瓶，封板胶纸2片 2.具体步骤Procedure for the ELISA test （protocol） （1）从冰柜中取出试剂盒，室温平衡30min,同时将浓缩洗涤液做1:20稀释 （2）加待测标本：取足