食用菌的基因工程精读.ppt

PEG(polyethylene glycol )法最早是由Davey等以矮牵牛悬浮细胞的原生质体为受体、Krens等以烟草无菌苗分离的原生质体为受体，在PEG的协助下开创性地把裸露的DNA直接转化植物原生质体而创立的，他们的研究结果为基因直接转移到受体细胞奠定了基础。 主要原理：PEG能使细胞膜之间或DNA与膜之间形成分子桥，促使细胞间的接触和粘连，或是通过引起表面电荷的紊乱，干扰细胞间的识别，而有利于细胞间的融合或外源DNA的进入。 主要应用：酵母、蘑菇、平菇、草菇 、鬼伞等 （一）PEG法； 电激法是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电激穿孔”（Electroporation）形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。该法自1979年Zimmerann发明以来，经过多年的研究和改进，已广泛应用于动物、植物的遗传转化研究上。1991年，Royer JC等首先采用电激法把编码二氢乳清酸脱氢酶基因URA1导入同源的杨树菇营养缺陷型突变菌株中，获得正常表达的杨树菇 ，接着蘑菇、平菇、草菇等也用该法进行遗传转化，获得转化子。 （二）电激法 基因枪法又称微弹轰击法（Microprojectile bombardment）,自Klein TM等1987年首次利用钨粒对洋葱的组织进行轰击试验以来，已被广泛应用于植物的遗传转化。 主要原理：将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高气压下微粒被高速射入受体细胞或组织。微粒上的外源DNA也随之被带入细胞并整合到植物染色体上，得到表达，从而实现了基因的转化。 应用：丝状真菌、蘑菇、草菇。 （三）基因枪法 这是九十年代发展起来的一种能较大幅度提高转化率的方法，其英文为Restriction Enzyme-Mediated DNA Integration， 简称REMI 。它是由Schiestl RH 等于1991年第一次在酿酒酵母菌（S. cerevisiae ）上创立使用[29] ，1992年Kuspa A等在网柄菌（Dictyostelium discoideum ）上发展了该法 。此法应用于旋孢菌（Cochliobolus heterosporus ） 、白色念球菌（Candida albicans ）和食用菌上的鬼伞（Coprinus cinereus ）、香菇（L.edodes）等的遗传转化均能有效地提高转化率。 （四）限制性酶介导的DNA整合法 主要原理：限制酶穿透细胞膜和核膜，在特异的酶切位点活体切断染色体DNA，产生的染色体DNA末端就会在宿主细胞酶系的作用下与限制酶切断的线性化的质粒DNA相连接。该法亦可作为REMI标签对功能基因进行分离。 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens ）是一种革兰氏阴性的土壤杆菌，它侵染双子叶植物的受伤部位并形成冠瘿瘤，在冠瘿瘤的形成中，农杆菌只留在植物细胞间隙中，其环状质粒Ti上的T-DNA在细菌内被加工、剪切、复制后转入植物细胞并随机插入到植物的基因组中。农杆菌介导的遗传转化系统是一种天然有效的遗传工程系统，已广泛应用于双子叶植物和单子叶植物的遗传转化研究上。 （五）农杆菌介导法 * * * 第6章 食用菌基因工程 Section 6 Genetic engineering in edible fungi 概念 食用菌外源基因表达系统 宿主的选择 载体构建 银耳芽孢外源基因表达系统 双孢蘑菇外源基因表达系统 基因工程实际上就是基因重组，就是按照人类的需要把这种生物的“基因”与另外一种生物的“基因进行重新组合，“组装”成新的基因组合，创造出新的物质或生物（基因工程菌）。这种完全按照人的意愿，由重新组装基因表达产生新的物质或新生的生物科学技术，就称为“基因工程”，或者说是“遗传工程”。 　　 　 基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。 什么是基因工程？ （1）目的基因； （2）表达元件及表达载体（即将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组 DNA）； （3）转化方法（把重组DNA引入某种细胞）； （4）重组体的筛选（把目的基因能表达的受体细胞挑选出来）。  基因工程的主要要素 食用菌外源基因表达系统 一、宿主的选择 现有外源基因表达系统的缺陷 大肠杆菌表达系统 蛋白质翻译后修饰加工体系不完善，表达蛋白活性 低或没有活性低； 细胞产生内毒素，影响表达蛋白的纯化； 细胞质内表达的目标蛋白形成包涵体颗粒，包涵体要用变性剂溶解，再通过复性才能得到在缓冲液中溶解的蛋白 酵母表达系统 表达产物过渡糖基化：酵母细胞合成糖链多为甘露糖残基，常形成过长的侧链，如cel基因的表达； 表达产物缺乏糖基化：如