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核酸分子杂交技术 探针制备 选择探针的原则 探针应对应着mRNA的特异区域 长度（200-1000 bp） 3‘-UTR? 与其它序列的同源性有较低或无同源性 1、模板的制备 体外转录合成反义探针的模板（原位杂交所用的探针）是DNA的编码链 体外转录合成正义探针（原位杂交中的阴性对照）的模板是DNA的模板链 实验操作 PBST（PBS+0.1%Tween）洗 15min×5次。 Coloration buffer 洗5min×2 次 Detection buffer 洗5 min NBT/BCIP stock solution 20 ul稀释到1ml detection buffer中，至于暗处显色。 15分钟后可观察一下，如显色较慢，可间隔时间较长再观察，如显色较快，需经常观察。 实验注意事项 试剂和容器处理：DEPC（焦碳酸二乙酯）或180 ℃ 需带口罩，手套，注意RNase-free 移除溶液时，应轻吸，以免损伤胚胎 加液时，应注意从侧面加入，以免直接冲击胚胎。 电子版上交mRNA在斑马鱼发育过程中的表达图式； 根据实验结果，推测该基因在早期发育的可能功能 思考：影响原位杂交成败的关键因子及原因； 如何保证探针的特异性 根据所给序列，确定基因的名字，并确定如何合成正义探针和反义探针（选哪个酶切，选哪个酶合成） * * * * * * * * * 实验方法 6、显色 Coloration buffer: 100mM NaCl; 50mM MgCl2; 100mM (Tris-HCl pH9.5); 0.1% Tween-20。 Detection buffer: 100mM NaCl, 100mM (Tris-HCl, pH 9.5） NBT/BCIP显色液(硝基四氮唑蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸盐): NBT 0.33mg/ml; BCIP 0.16mg/ml; 1mM 左旋咪唑, 暗处显色 Whole mount in situ hybridization 实验方法 照相记录结果 Whole mount in situ hybridization Example of zebrafish fgf17b Cao Y et al., Developmental Biology 271 (2004) 130–143 Example of Amphioxus BMP signaling molecules Yu et al., Nature 445 (2007) 613–617 杂交中的关键问题 对照的设定 A、为了说明组织RNA的完整性，用管家基因探针或Poly d（T）探针做阳性对照。 B、为了说明探针和目的基因的结合是特异的，用正义探针做阴性对照。 Whole mount in situ hybridization 杂交中的关键问题 胚胎的渗透处理： 信号VS胚胎完整性 需实验来摸索 Whole mount in situ hybridization Trouble shooting 无信号： 1、胚胎固定不好，RNA降解； 2、渗透处理不够，探针没能充分进入胚胎； 3、杂交温度过高； 4、洗脱条件过于苛刻 Whole mount in situ hybridization Trouble shooting 阴性对照有信号： 1、探针的特异性差； 2、杂交条件不够严谨； 3、洗脱条件不严谨。 Whole mount in situ hybridization * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 杂交技术的原理 杂交：核苷酸序列通过Watson-Crick碱基配对原则形成稳定的杂合双链核酸分子的过程，称为杂交。 杂交的三种形式：DNA-DNA,DNA-RNA和RNA-RNA，其稳定性依次增大。 检测对象：提纯的核酸和细胞内的原位的核酸。 核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性。主要应用有：克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定位、定性、定量检测、特定基因的时空表达模式和疾病的诊断等方面。 Whole mount in situ hybridization Southern and Northern blotting 原理 整体原位杂交（ Whole mount in situ hybridization ），是一种应用标记探针与经处理的胚胎中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。 特点：优点是可以显示、比较许多特定基因的分布情况，缺点是无法显示其相对量的情况，可能与蛋白表达位置不符，不能鉴定选择性剪切的产物，费时、一定的技术难度。 整体原位杂交已经成为基因表达定位和表达分布模