培训课件--抗肿瘤药效评价.ppt

抗微核形成实验 微核试验是检测环境致癌物、化学诱变剂引起染色体损伤的一种快速、简便的方法。 原理：遗传毒物或化学诱变剂作用于间期细胞染色质或有丝分裂染色体和纺锤体时，能导致染色体断裂、断片或整条染色体从纺锤体脱落、继而在分裂末期及以后的间期细胞中形成与主核脱离的微核。 抗Ames试验 Ames试验或称鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验，是一种经济、敏感和应用广泛的检测原核生物基因突变的方法。 原理：利用沙门氏菌(S.typhimurium)的遗传基因突变性质，以组氨酸要求性的变异(his-—his+)为指标，当这些菌株欠缺DNA损伤的修复功能时，对多种致突变物质具有很高的敏感性。一般通用的菌株是TA97、TA98、TA100和TAl02。 非程序DNA合成抑制实验 非程序DNA合成(UDS)是指发生在S期以外的与DNA损伤有关的一种DNA合成。 它可以通过同位素标记的特异前体(常用3H—胸腺嘧啶核苷)参入DNA而显示。UDS是目前公认的检测真核细胞基因突变或损伤修复的有效而经济的一种方法，在当前被用于研究受试物质的抗始发突变作用。 原理：依据体细胞突变学说，化学致癌物通过对DNA的攻击而导致细胞癌变。化学致癌物造成的DNA损伤有三种主要类型：碱基损伤、链断裂和交链形成。这三种损伤均可引起细胞启动其修复过程而进行DNA修复。DNA损伤的修复过程十分复杂，对不同的阶段有不同的检测方法。一般习惯上把放射性自显影及液体闪烁计数法显示的非半保留复制的抑制称为非程序DNA合成抑制试验。 肿瘤细胞耐药表型和机制 肿瘤细胞耐药性按耐药性来源可分为内在耐药和获得性耐药，按耐药表型(即对一种或同时对多种结构和作用机制不同的药物发生耐药)来分，可分为原药性和多药耐药性两种。 5. 逆转肿瘤耐药性药物的药效学评价 体外细胞培养的方法 建立耐药的肿瘤细胞株： 例如可以用逐步增加培养基中阿霉素浓度的方法，诱导出一株耐阿霉素的人源性白血病细胞系。 缺定剂量：测定被检测药物在敏感细胞株和耐药细胞株的细胞毒性，用无毒剂量或小于IC10的剂量进行试验。 测定细胞存活率：多采用MTT法。求出各试验组存活率(或抑制率)，效果评价用逆转倍数(FR)： FR=IC50（不加逆转剂）/ IC50 （加逆转剂） 6. 抗肿瘤侵袭、转移药物的药效学评价 肿瘤转移的基本步骤： 原发瘤增殖，肿瘤新血管生成。 肿瘤细胞侵袭毗邻的基底膜、基质和正常细胞。 瘤细胞穿入血管或淋巴管并在循环系统中存活。 瘤细胞栓塞、滞留于远隔靶器官的微血管中并增殖。 瘤细胞穿出血管或淋巴管，在靶器官内形成微转移处。 肿瘤问质内新血管生成，转移瘤快速生长。 抗肿瘤侵袭与转移药的评价可以通过动物实验和体外细胞培养两种方法进行。 动物实验： 例：小鼠子宫颈癌U14肾侵袭模型 小鼠子宫颈癌U14是昆明种小鼠的宫颈癌。此瘤株后被移植于615近交系小鼠，致瘤率近100％，并呈现血道和淋巴道双重转移的特性。 将U14瘤块接种于615小鼠的肾包膜下，肿瘤生长并向肾实质内侵袭。荷瘤肾脏病理切片后，在光镜下观察，用组织学半定量分级标准判定肿瘤侵袭肾实质的程度。 体外实验： 例1：肿瘤细胞球样聚集体的侵袭模型 通过旋转摇动培养系统将肿瘤细胞制成球样聚集体，在半固体琼脂培养基上与球形鸡胚心肌小块紧密接触，使两者成为复合体。复合体经过一定时问的旋转摇动培养后，组织学切片观察肿瘤细胞对心肌组织的侵袭程度。 该侵袭模型的特点： 经过旋转摇动培养后，心肌块的外围被成纤维细胞层包绕，使宿主组织表面形成类似浆膜样的结构。 心肌组织结构清楚，容易与肿瘤细胞相区别。 攻击细胞为球体形式，模拟了体内实体瘤结构，便于观察恶性细胞在接触宿主组织后，如何离开瘤母体而向宿主组织侵袭的过程。可用于癌侵袭过程定量和侵袭形态学模式的研究。 例2：癌细胞对基底膜的浸润实验： 用一个孔径为8μm的滤膜作为实验用基底膜。膜的上面用半固体凝胶覆盖；下面用纤粘连接素覆盖。B16-BL6细胞加在上面，孵育一段时间后，将下面的细胞固定染色，进行细胞计数，用以判定细胞的浸润情况。 例3. 血管内皮细胞生长因子抑制实验： 选择特定的肿瘤细胞株，进行培养，测定培养基中血管内皮细胞生长因子的含量或用RT-PCR测定血管内皮细胞生长因子基因的表达情况。 7. 放疗及化疗增敏剂的药效学评价 对肿瘤细胞没有毒性或有细胞毒作用，但用小于药物的有效剂量或毒性剂量与放射线合并作用于肿瘤细胞时能加强杀伤肿瘤细胞作用的药物就被认为是放疗增敏剂。 可以用MTT法检测放疗或化疗增敏剂的活性，比较加和不加增敏剂细胞的死亡情况。 放射增敏及化疗增敏的临床应用，将遇到正常组织的耐受性问题。因此，在评价任何增敏剂的临床应用可能性