疟原虫检验技术幻灯片.pptVIP

疟原虫镜检技术 西双版纳州疾控中心 李鸿斌 ●分子生物学、血清学技术发展迅猛,但是确诊疟疾的“金标准” 仍然是血液显微镜检查 ●显微镜检查是唯一可鉴别4种疟原虫的方法 ●厚薄血涂片的检查仍被认为是不可替代的疟疾诊断的金标准 厚薄血膜的制作 取血部位和血量 取血方法 采血部位：耳垂或无名指，通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，右手持消毒针迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻挤压出血。厚血膜血量约一粒米大小。 标准的疟疾厚薄血膜片位置 厚薄血膜的标准 ●厚血膜血量适宜，不宜过多或过少 ●薄血膜平整,无皱折和空泡.红细胞单层排列 血片染色 吉氏染液(原液)的配置 吉氏染粉 (Azure B type) 5g 甘油 (纯) 250ml 甲醇 (纯) 250ml ●吉氏粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨, 然后边加边磨，直至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在 研钵中加入少许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀，置于室内，每天晃动数分钟，存放一周后经过滤即可使用。保存时间越长染色效果越好。 ●整个染色液配制时间不能少于5个小时 稀释吉氏原液 ●原液需经缓冲液或净水稀释后，方可用于厚薄血片染色。 ●吸取母液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物泛起影响染色效果. 操作1 （快染） 量筒内量2ml缓冲液或净水，直接滴加吉氏原液7滴，混匀，滴入待染标本的厚薄血膜上，染色10min，清水细缓冲洗，晾干镜检。 操作2 (慢染) 在量筒内量2ml蒸馏水或净水， 再滴加吉氏原液4滴，混匀，滴入待染标本上，染色30~40min。清水细缓冲洗，晾干镜检。 质量好的染色 : 显微镜下核呈红色,胞浆呈蓝色 如果血片偏红,说明染液偏酸性 如果血片偏蓝,说明染液偏硷性 染色过程 血片平置于染色板上 用吸管吸取已稀释的吉氏液约2ml于厚薄血 膜上，染色10 min 清水细缓轻轻冲去染液 置玻片于插板上，自然晾干 血片制作注意事项 ● 载玻片必须清洁无油污，不然会影响血片制作和镜检结果． ● 用甲醇固定薄血膜时，甲醇不要接触到厚血膜 ● 血片充分干燥后染色，清水细缓冲洗。防止厚血膜脱落. ● 配置吉氏母液必须过滤除去杂质颗粒，有助于提高镜检质量． 疟原虫密度计算 计算疟原虫密度的三种方法： ● 白细胞原虫密度计数法　(厚血膜 WHO) ● 半定量计数法 (厚血膜) ● 红细胞感染密度计算法　(薄血膜) ● 在厚血膜按视野顺序，从看到第一个疟原虫开始计数，记录200个白细胞中的疟原虫数（可分有性体和无性体），如果原虫密度较低，可增加白细胞计数500~ 1 000 个。 ● 白细胞疟原虫计算公式： 疟原虫数 ÷ 计数的白细胞数 × 患者每微升血白细胞数 = 疟原虫数/μl血。 ● 如果不知患者的白细胞数，则每微升血以8 000个白细胞计数(国际标准) 。 白细胞疟原虫计数法举例 ●假设计数200 WBC中有35个疟原虫，在不知患 者白细胞数的情况下，以每微升血8000个白细 胞计数, 由此计算出每微升血液疟原虫密度为： 显微镜下（10目镜Χ100油镜）选择红细胞排列整齐密集，无重迭的视野（ 约300红细胞/视野） 红细胞疟原虫密度按以下公式计算： 1.红细胞疟原虫感染率（%）计算　　　　　　　　　 红细胞原虫感染率（%）= 疟原虫数 ÷计数的红细胞数X 100 2.红细胞疟原虫感染密度计算 红细胞疟原虫密度=红细胞原虫感染率X红细胞数/每微升血 （男性500万个/μl；女性450万个/μl） 人类四种疟原虫的 基 本特征 感染人的疟原虫有四种: 恶性疟原虫 P. falciparum 间日疟原虫 P. vivax 三日疟原虫 P. malariae 卵形疟原虫 P. ovale 恶性疟 P.falciparum ● 分布热带、亚热带，是非洲的重要疾病 ● 我国流行区域为云南省和海南省 ● 四种疟原虫中致病力最强，无免疫力者 感染后出现急性症状,不及时治疗可危及生命 间日疟 P.vivax ● 间日疟原虫分布于我国大部分地区,主要是中部地区 ● 病程良性, 有复发 三日疟