两水相萃取法.ppt

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四、影响分配的参数 主要有:聚合物的分子量和浓度、pH、盐的种类和浓度、温度等。 适当选择各参数,可达到较高的分配系数和选择性。 两水相萃取法的一个重要优点:可直接从细胞破碎匀桨液中萃取蛋白质而无需将细胞碎片分离,因而在一步操作中可达到固液分离和纯化两个目的。 改变pH和电解质浓度可进行反萃取。 当聚合物的分子量降低时,蛋白质易分配于富含该聚合物的相。 例如:在PEG—Dx (Dx 代表葡聚糖Dextran)系统中,PEG的分子量减小,会使分配系数增大,而葡聚糖的分子量减小,会使分配系数降低。 此为普遍规律,不论何种成相聚合物系统,或何种进行分配的生物高分子都适用。 (一)、聚合物的分子量 (二)、聚合物的浓度 当接近临界点时,蛋白质均匀地分配于两相,分配系数接近于1。 如成相聚合物的总浓度或聚合物/盐混合物的总浓度增加时,系统远离临界点,系线的长度也增加,此时两相性质的差别也增大,蛋白质趋向于向一侧分配,即分配系数或增大超过1,或减小低于1。 当远离临界点时,系统的表面张力也增加。如果进行分配的是细胞等固体颗粒,则细胞易集中在界面上,因为处在界面上时使界面面积减小,从而使系统能量减减小,但对溶解的蛋白质来说,这种现象比较少见 (三)、盐类的影响 各种无机离子在PEG – Dx 两相中的分配系数如表19—2所示: 由于各相应保持电中性,因而在两相间形成电位差,这对带电生物大分子,如蛋白质和核酸等的分配,产生根大影响,参见式(19—10)。 例如:加入NaCl对卵蛋白和溶菌酶分配系数的影响见图19-4。 由此可见,加入适当的盐类,会大大促进带相反电荷的两种蛋白质的分离。 当盐类浓度继续增加时,影响逐渐减弱,分配系数基本上无变化。 当盐类浓度很大时,则由于盐析作用,蛋白质易分配于上相,1ogK几乎随NaCl浓度增大,而线性地增大(图19—5)。各种蛋白质的增大程度有差异,利用此性质,可使蛋白质相互分离。 由于HPO42-离子在PEG一葡聚糖系统中的分配系数很小,因而加入pH大于7的磷酸盐缓冲液能很方便地改变相间电位差,而使带负电荷的蛋白质移向富聚乙二醇的相。 (四)、pH的影响 pH会影响蛋白质中可以离解基团的离解度,因而改变蛋白质所带电荷和分配系数。 根据式(19—10),当系统一定时,分配系数K与荷电数Z的关系可表示为: (19—21) 式中γ与系统的组成、加入的盐类和温度等有关。 对一些已知PH与荷电数之间的关系的蛋白质,如溶菌酶和卵蛋白的研究表明,确实符合于上式。 pH影响磷酸盐的离解程度,若改变H2PO4- 与HPO42-的比例,会使相间电位发生变化而影响分配系数。pH的微小变化有时会使蛋白质的分配系数改变2—3个数量级。 研究分配系数与pH的关系时,如加入不同的盐类,则出于电位差不同,这种关系也应不同。但在等电点时,得到的是不带电荷分子的分配系数,对不同的盐类系统,应有相等的值。 因而在不同的盐系统中,分配系数与PH的关系曲线的交点即为等电点。这种测定等电点的方法称为交错分配。例如血清清蛋白的交错分配见图19—6。 (五)、温度 温度影响相图,特别在临界点附近,尤为显著,因而也影响分配系数。但是在离临界点较远时,这种影响较小。 大生产中,总采用常温,可节约冷冻费用,这是由于聚合物对蛋白质有稳定作用,不会引起损失。同时,温度高时,粘度较低,有利于相的分离操作。 (六)、荷电PEG作为成相聚合物 在聚合物上引入电荷可以增大两相间的电位差。可以在PEG或聚葡糖上引入带电荷的基团。但从式(19—19)来看,相间电位差与电荷数成反比,而每一葡聚糖分子上可以引入很多带电荷的基团,故效果较差。相反每一分子PEG只含两个羟基,只能引入两个荷电基团,故使电场增大的效果较好。 几种带正电或负电的PEG衍生物:带正电;三甲胺基PEG(TMA-PEG):氨基PEG(PEG—NH2)。带负电:PEG-磺酸盐;羧基一PEG(PEG一COOH). 利用荷电PEG能产生较大的相间电位,故能使分配系数

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