医学细胞生物学设计性实验详解.doc

医学细胞生物学设计性实验方案 — 细胞核分离与鉴定 动物细胞融合 2014级全科五班 1413650548 付晓雪 1413650549 杨久慧 1413650558 曾 桃 1413650556刘梦蝶 1413650559 付 梅 1413650560张 义 细胞核的分离与鉴定 实验目的掌握细胞核分离的，了解细胞核分离与鉴定的方法2.匀浆的基本操作。内各种结构的密度和大小等，在同一离心场内其沉降速度也不同，所以常用不同的介质和不同的离心力离心），细胞内各细胞器和组分分级分离。方法已经成为研究亚细胞成分的化学组成理化特性及功能的重要手段。的密度和大小与细胞内其他组分不同，分离细胞核常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中特定的离心力进行离心分离然后进一步鉴定。基本过程包括组织匀浆分级分离和分析三个步骤。 指低温下，将组织块放入匀浆器中，加入等渗介质进行研磨，破碎细胞，使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆液 甲苯胺蓝是常用的人工合成染料的一种，属于醌亚胺染料类，这类染料一般含有两个发色团，一个是胺基，一个是醌型苯环。为碱性染料，甲苯胺蓝中的阳离子有染色作用，组织细胞的酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色。 实验步骤： 1、处死：处死小白鼠，尾部使其血液尽量流出。 2取材结缔组织盛生理盐水的烧杯中反复洗涤。 ：的看不见组织块 4、过滤：用纱布匀浆离心管中。少量生理盐水润湿纱布 5、离心：min，取上清液置于另一离心管中剩余ml左右的上清液。 制作：制一张涂片将原离心管剩余的上清液吹打沉淀成悬液，制成另一张涂片标记。 洗涤：滴加甲苯胺蓝染液，染色~7分钟。晾干。 ：涂片在显微镜下观察。 1.尽可能剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不易过长，以保持组分生理活性。 2.将匀浆液过滤于离心管中后要及时离心，以防止浆液的颗粒自然下沉过快，影响后面离心分层效果。离心转速应由慢到快。 3.涂片制作过程要把握好涂片的力度，不可太厚。 4.染色后的洗涤注意时间，不可过长，避免将染色洗去，观察不到细胞核。 5.开腹后取肝，应用生理盐水反复冲洗，避免血细胞对实验的影响。 预期结果： 低倍镜下找到标本，在换到高倍镜，可见肝细胞的细胞核已经游离出来，圆形，被染成蓝紫色，核仁有2-4个甚至更多。 实验仪器、设备、器具表 名称 规格 用量 说明 显微镜 1 离心机 1 天平 1 离心管 2 玻璃漏斗 1 烧杯 25ml 1 解剖剪 1 镊子 1 纱布 玻璃匀浆器 1 载玻片 2 盖玻片 2 小白鼠肝脏 1 生理盐水 蔗糖 0.25mol/L 氯化钠 0.003mol/L 甲苯胺蓝染液% 动物细胞融合 实验目的： 掌握PEG诱导细胞融合的基本原理。 了解PEG诱导细胞融合的操作步骤。 实验原理： 细胞融合是指两个或两个以上的细胞合并成为一个细胞的过程。在自然情况下发生的融合叫自然融合，如精子与卵细胞的融合。在通常情况下由于细胞膜的存在使细胞不易发生融合现象，但在特殊情况下，如病毒诱导、化学试剂诱导、电诱导等可以改变细胞膜的结构，使细胞发生融合，这种办法叫做人工诱导融合。在实验室中常采用化学诱导剂聚乙二醇（PEG）的方法诱导细胞融合较为简便和安全。 PEG可以改变细胞的的膜结构，使细胞相互接触的膜脂双层中磷脂分子发生疏散，进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲和以及彼此表面张力的作用，引起相邻的重排质膜在修复时相互合并在一起，使相邻细胞的胞质沟通，从而造成相互接触的细胞之间发生融合。 实验步骤： 一、鸡血细胞的制备 将2ml新鲜的鸡血(鸟类的红细胞中有细胞核)注入到有一定肝素钠（抗凝血剂）的烧杯中，混匀，加入8ml的Alever溶液（保持鸡血的完整性），配置成1:4的细胞悬液。 取1~10ml上述细胞悬液，加入9ml的0.85%生理盐水，混匀后离心5min(1000r/min)，倒掉上清液，在按上述条件重复离心2次。然后加入8~10ml的Hanks液，配置成10%的鸡血细胞悬液。 二、50%PEG溶液的制备 取一定量的PEG（Mr=4000）放入试管，用试管夹夹住，在酒精灯上加热，使其融化，带冷却至50~60℃时，加入预热的等体积Hanks液混匀，置37℃水浴箱中保温待用。 三、细胞融合 1.取10%的鸡血细胞悬液1ml放入离心管中，加入5mlHanks液混