甲基化干扰实验.ppt

研究DNA-蛋白质相互作用的实验方法Methylation interference assay（甲基化干扰实验 ） 意义：在许多的细胞生命活动中，很多过程都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用的问题。重组DNA技术的发展，人们已分离到了许多重要的基因。现在的关键问题是需要揭示环境因子及发育信号究竟是如何控制基因的转录活性。 为此需要：a、鉴定分析参与基因表达调控的DNA元件；b、分离并鉴定这些顺式元件特异性结合的蛋白质因子； 这些问题的研究都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用。 Methylation interference assay（甲基化干扰实验） 定义：通过对核苷酸进行甲基化修饰，检验DNA链中哪些区域与特定蛋白质结合的试验方法。 原理：根据DMS（硫酸二甲酯）能够使DNA中裸露的鸟嘌呤残基甲基化而六氢吡啶又会对甲基化的鸟嘌呤残基做特异性的化学切割这一原理设计的一种研究蛋白质同DNA相互作用的实验方法。 实验步骤： 用DMS处理靶DNA使之局部甲基化（平均每条DNA只发生一个G碱基甲基化作用） ?? 同细胞蛋白质提取物一起进行温育，促进使DNA与蛋白质的结合 ?? 进行凝胶电泳形成两种靶DNA条带： a、??? 其一没有同蛋白质结合的DNA正常电泳条带 b、其二同特异蛋白质结合而呈现滞后的DNA电泳条带 将这两种DNA电泳条带分别从凝胶中切出，并用六氢吡啶进行切割，结果为： ?? a 、甲基化的G残基被切割:因为转录因子蛋白质只能够同未发生甲基化的正常的结合位点结合，所以在转录因子DNA结合位点序列中的G残基如果被DMS甲基化之后，转录因子就无法同其结合位点（顺式元件）发生结合作用，从而使得结合位点中的G残基同样也要被六氢吡啶切割； ?? b 、不具有甲基化G残基的靶DNA 序列则不会被切割 ?? 将结合蛋白质的DNA条带和不结合蛋白质的DNA条带，经六氢吡啶切割作用之后，再进行凝胶电泳 ?? 作放射自显影，读片并分析结果 结果判断: a、同转录因子蛋白质结合的靶DNA序列，经六氢吡啶切割之后，电泳分离呈现两条带，有一个空白区 ?? b、不同转录因子蛋白质结合的靶DNA序列，经六氢吡啶切割后，电泳分离呈现三条带，没有空白区域的出现。 应用： a、甲基化干扰实验可以用来研究转录因子与DNA结合位点中的G残基之间的联系； ?? b、是足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹实验中DNA与蛋白质相互作用的精确位置 该技术的优缺点 优点：应用这种技术可以检测靶DNA中G残基的优先甲基化，对尔后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细的揭示出DNA与蛋白质相互作用的模式。 缺点：DMS只能使DNA序列中的G和A残基甲基化，而不能使T和C残基甲基化 * *