第四章 电泳图谱图像的的分析及蛋白质消化技术.ppt

回顾 蛋白质表达谱 使用2D凝胶的比较蛋白质组学 比较蛋白质组学最常用的方法是用两个样品进行2D-SDS，比较蛋白质点的图型。 研究人员已进行了大量工作来开发分析2D凝胶蛋白质点图型分析软件工具。此外，也开发出保存这些信息的大批数据库。 双向电泳分析软件 ImageMaster 2DElite （MelanieTM） PDQuest 6 0 英国公司Nonlinearn Dyanamics Ltd的Progenesis 德国Decodon GmbH的Delta 2D等 图像分析的基础： 使用文件扫描仪，但最好使用CCD获得图型。程序首先评估凝胶的“特征”，他是指与凝胶本底相比显现的重要不同。“特征”相当于凝胶上的蛋白质点。可以通过光密度（OD）、大小和体积（整个蛋白质点面积上的OD）来鉴定特征。这些鉴定参数是一块凝胶中或多块凝胶之间特征比较的基础。 第一节 电泳图谱的图像分析 凝胶的图像处理分析及细胞蛋白谱的建立 典型流程 凝胶图像的扫描： 图像加工： 斑点检测和定量： 凝胶配比： 数据分析： 数据呈递（report） 2-DE数据库的建立： PDQuest 软件简介 PDQuest软件是显示（imaging）、分析（analyzing）双向电泳图谱＆数据库查询的一个软件包 硬件：一定的电脑配置,Pentirm 166处理器，64M内存，3G硬盘，1024*768分辨率 ，256色，SCI接口，windows操作系统 软件： PDQuest双向凝胶图像分析软件，Bio-Rad Laboratory,Hercules,CA PDQuest 软件的使用 PDQuest 软件 用工具栏的crop可以切割掉凝胶边缘没有蛋白质点的部分，以减少分析的复杂性，但要注意对你要分析的多块凝胶图像最好是切割成同样大小。（在操作时先选择其中的一个凝胶图象并选定要切割的区域，然后在imageadvance cropsave crop settings下保存crop的设定条件并输入保存的名称，其他的图象切割时在imageadvance cropload crop settings中选定先前保存的名称即可 ） Matchset 建成后，接着便是设立标志点（landmark）,它的作用是对整个凝胶上蛋白质斑点进行排列（align）与定位（position）以便进行匹配（match）。单击工具栏中的match tools图标会出现一个窗口，其中有 landmark, unlandmark, match gel, match all gels等斑点匹配的工具, 在match菜单中也有这些工具。标志点应选择分辨良好，且所有成员胶上均出现的蛋白质斑点，并尽量避开蛋白质斑点聚集的地方，最好在不同的放大倍数下确定该蛋白质斑点为所有成员胶上同一个蛋白质斑点。至少要设立两个标志点后便可利用PDQUEST的自动匹配功能来完成不同凝胶上的蛋白质斑点的匹配了。一般设立的landmark斑点个数为总斑点的10%左右，要用肉眼检查每一个应该能匹配上的斑点是否匹配上了。 对错误匹配的蛋白质斑点或没有识别到的匹配可进行手工方式编辑。在这里也可以进行编辑斑点功能，单击viewinterchange all images, 这样所有的成员胶和参考胶有Gel spot 状态下变成了Gel image, 而在Gel image 状态下可进行Edit Spot Tools 以编辑蛋白质斑点。 比较（Compare）形式有两种，一种是Gel, 可以单个的胶两两互相比较(只能是成员胶和参考胶进行比较)，另一种是Group，可以将同一样品的多块胶做为一组（这在Database Replicate GroupCreate Group下可以创建组），然后再组之间两两比较。然后再选择A 和B，分别表示两块胶或者是两组胶。 在Select Spots Which are 中可以选择Increased, Increased or Decreased 或者是Decreased 等，激活选项后可以输入倍数关系, 默认的是2 times, 可以输入其他数值， 如3 times。参数设好后就单击go, 在参考胶上就会出现黄色圈标记的蛋白质斑点，如果你选择是Increased BA 2 times, 那么这些黄色圈标记的蛋白质斑点即为在量上B大于A 两倍的蛋白质点. 为了矫正银染对蛋白质点定量分析的影响，所有点的含量通过单个点的光密度值比胶上所有点光密度质而正常化（Normalize）, 单击EditNormalize, 出现一对话框，选择左上角Enable Normalize，下面的窗口被激活， 单击Reports 下的Scatter plot，会出现散点图分析的