微生物次生代谢产物研究方法-2.ppt

第二讲 色谱学原理与实际应用（1） 色谱学基本原理与分类 薄层色谱 分析型、制备型 各种常用(常压)液相柱色谱 正相柱、反相柱、凝胶柱、大孔吸附树脂柱、活性炭柱、聚酰胺柱、离子交换柱、干柱色谱 一、色谱原理与分类 色谱法(chromatography)早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。 他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。 原理： 当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。 其他概念： 分配系数(K) 分配比/容量因子(k) 滞留因子(Rs) 二、天然产物化学研究中常用色谱手段 薄层色谱 分析型、制备型 柱色谱 正相柱、反相柱、凝胶柱、大孔吸附树脂柱、活性炭柱、聚酰胺柱、离子交换柱、干柱色谱；减压柱色谱、中低压柱色谱、高压液相色谱、气相色谱 1 薄层色谱（TLC, thin layer chromatography） 分类： 吸附薄层色谱法 分配薄层色谱法 （分子排阻薄层色谱法） 基本概念 比移值(Rf值) 溶质移动距离与流动相移动距离之比。（速度之比） Rf =L/L0 （定时展开） L为原点（origin）至斑点中心的距离，L0为原点至溶剂前沿（solvent front）的距离 与组分及色谱条件有关（有系统误差，有时很大） 1.1 分析型薄层层析 正相板 常用吸附剂（固定相）：硅胶GF254 或（酸性/中性/碱性）氧化铝 （含黏合剂、荧光剂） 流动相：有机溶剂 层析装置：层析缸 上样：毛细点样管或微量注射器（定量） 上样量：几微克～几十微克 吸附薄层层析原理（当正相板吸附水分较少时）： 吸附过程是样品中组分分子与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心，组分在薄层板上吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，……，利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离。 　　 一般极性强的组分K大，Rf值小；极性弱的组分 K小，Rf值大。极性强的溶剂洗脱力争夺吸附剂活性中心能力强，洗脱力度大，反之极性小的溶剂洗脱力度也小。一般用强极性与弱极性溶剂配成一定比例的混合溶剂可以达到较好的分离效果。 分配薄层层析原理（当正相板吸附水分较多时） 极性溶剂如水吸附在硅胶等基质表面成为固定相，多次分配的过 程，分配系数（溶解度）不等实现分离。 迁移规律同上 TLC常用正相吸附剂 氧化铝（Al2O3） 活性基团铝醇基，氧化铝具有分离能力强、活性可以控制等优点。 碱性氧化铝 pH 9～10 适于分析碱性、中性物质（尤其是生物碱类） 中性氧化铝 pH 7.5 适于分析酸性、碱性和中性物质 酸性氧化铝 pH 4～5 适于分析酸性、中性物质 操作要点： 商品硅胶板常为大尺寸，需玻璃刀裁减使用（氧化铝铝板裁剪）； 点样面积尽量小（f ? 3mm ）； 样品点间间隔及距离边缘至少6mm； 尽量避免使用难挥发溶剂溶解样品点样； 层析缸溶剂需经一段时间气液相饱和才能使用（边缘效应的原理）； 注意观察样品的荧光性质（254nm，365nm）； 根据样品的特性选用合适的显色剂。 反相板 固定相：RP-18 / ODS (化学键合在硅胶基质上的C18烷基链) 流动相：极性溶剂（甲醇/水，乙腈/水，或添加改性溶剂如 甲酸、乙酸、三乙胺等） 分离原理（疏溶剂理论）： 化学键合在硅胶基质上的C18长链成为固定相，溶质由于受到极性溶剂排斥力作用而产生溶质与固定相之间的疏溶剂缔合。另外，硅胶基质的残留硅醇基有一定影响，使出现拖尾等现象，可加改性剂改良。(双保留机制) 在反相固定相上，一般极性强的组分K小，Rf