实验三 PCR基因扩增.docVIP

实验三 PCR基因扩增 一、实验目的 掌握PCR反应的基本原理与实验技术 二、实验原理： PCR Polymerase Chain Reaction -聚合酶链式反应，可以选择性扩增一段DNA序列。其基本步骤是，首先将待扩增的模板DNA变性使之成为单链，DNA样品中，特异性的引物能够与其互补的序列杂交，在dNTPs和Taq酶存在时，就可以合成模板DNA的互补链，反应完成后，将反应混合物加热使DNA双链变性，温度下降后，过量的引物又可以开始第二轮的合成反应。这种延伸—变性—退火—延伸的循环可以重复多次，使所需要的DNA片段得到特异性的扩增。 变性：加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链. 退火：使溶液温度降至50～60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合. 延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合 物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTPs），按5ˊ→3ˊ方向复制出互补DNA.上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。 三、仪器、实验用品、试剂 一、仪器 PCR仪 冰箱 电泳仪 微波炉 电泳槽 离心机 紫外检测仪 二、试剂 PCR Buffer TAE 500ml Ice 琼脂糖 Tag 溴化乙锭 d NTPs 溴酚蓝 模板DNA marker Primer1 Primer2 石蜡油 三、其它用品 移液器 （一套） Tip（一套） PCR管 0.2ml 防护眼镜 一次性手套 胶带 四: 实验步骤 1、PCR（范提供）反应体系 10x Bf 1x 2.5ul Tag 5u/ul 0.2ul D NTPs 2.5um 2.0ul Primer1 10um 2.5ul Primer2 10um 2.5ul DNA 2.0ul H2O to 25ul 混匀，加石蜡油 2、PCR反应程序 94℃ 预变性 5’ 以下35cycle 94℃ 变性 1.5min 50/55℃ 退火 30s 72℃ 延伸 1-2min 最后72℃ 5min 3、琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果 配制1％琼脂糖凝胶，取10ul扩增产物电泳。