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简析限制性内切酶 　　限制性内切酶（即限制酶）是基因工程中的必用操作工具之一。基因工程是近年来高考中的热点，而对于限制酶的考查也是历年高考题中的常考知识点。 　　1限制酶的作用及影响因素 　　1.1 作用：切割特定的核苷酸序列 　　[高考赏析]（2008，全国I）已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指，如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现在多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是（ ） 　　A.3 B.4 C.9 D. 12 　　【答案】C 　　【解析】：每一种限制性内切酶切割DNA后会留下特征性的粘性末端，同时一次切割后，会把DNA分割成两个片段，且不同的内切酶切后的片段不一样。若在3个酶切点切断，得到4种长度不同的DNA片段；若在2个酶切点切断，得到3种长度不同的DNA片段；若在1个酶切点切断，得到2种长度不同的DNA片段。因此最多能产生4+3+2=9种长度不同的DNA分子。 　　1.2 作用结果：形成DNA片段末端 　　黏性末端：错位切，切下后的两端形成一种回文式的单链末端。 　　平末端：平切，在两条链的特定序列的相同部位切割，形成一个无黏性末端的平口。 　　[高考赏析]（2008，江苏）将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。 　　请根据以下图表回答下列问题。 　　（1）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是 。 　　（2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。表1为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？__________。 　　（3）图1步骤③所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有专一性要求？ 。 　　（4）为将外源基因转入马铃薯，图1步骤⑥转基因所用的细菌B通常为 。 　　（5）对符合设计要求的重组质粒T进行酶切，。假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图1中标示的酶切位点和表2所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。 　　①采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切，得到_________种DNA片断。 　　②采用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切，得到_________种DNA片断。 　　【答案】（1）耐高温 （2）引物对B （3）否 （4）农杆菌 （5）①2 ②1 　　【解析】：由图1―①过程知，用EcoRI酶和AluI酶切割抗原基因DNA片段会得到XY片段，由图1―②过程可知，用EcoRI酶和SmaI酶切割质粒产生MN片段。这样形成的两个DNA片段用DNA连接酶形成重组质粒。其中X、M连接处是EcoRI酶切割位点，M、N之间还有一个PstI酶切割位点。如果用EcoRI酶和PstI酶切割重组质粒，将会在两个切割位点切割产生2种DNA片段。但若用EcoRI酶切割重组质粒，由于只有一个切割位点，所以只产生一个DNA片段。 　　[高考赏析]（2005、天津理综II 31）限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是―G↓GATCC―，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是―↓GATC―。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。 　　①请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。 　　②请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。 　　③在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接起来？为什么？ 　　【答案】： 　　① 　　② 　　③、可以连接。因为由两种限制性内切酶切割后形成的黏性末端是相同的。 　　【解析】：基因工程中往往用相同的限制性内切酶切割目的基因和运载体，但不同的限制性内切酶所切割出的黏性末端是相同的，也是可以互补配对的。因此，基因工程中有时也采用不同的限制性内切酶切割目的基因和运载体。 　　1.3 作用实质：使特定部位的两核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 　　1.4 影响因素：限制酶是一类酶，因此其活性受温度、pH等因素的影响。 　　[高考赏析]（2007、全国II）下列有关基因工程中限制性内切酶的描述，错误的是（ ） 　　A、一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列 　　B、限制性内切酶的活性受温度影响 　　C、限制性内切酶能识别和切割RNA 　　D、限制性内切酶可以从原核生物中提取 　　【答案】：C。 　　【解析】：由以上分析可知限制性内