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Northern blotting Northern印迹杂交（Northern blotting）：是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。Northern 印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后用低盐缓冲液洗脱，否则RNA会被洗脱。在胶中不能加EB，因为它会影响RNA与硝酸纤维素膜的结合。为测定片段大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照像，样品胶则进行Northern转印。琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时，甲基氢氧化银是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。 仪器 恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV 交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶等。 材料 总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA 25 ng ，尼龙膜 试剂 NorthernMax Kit（Cat. # 1940，Ambion, Inc.），琼脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer， dNTP Mixture，111TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，双氧水, 灭菌水等。 4. 方法与步骤 4.1 用具的准备： 180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。 电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。处理DEPC水 2 L 备用。 4.2 用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染。用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。 4.3制胶： 4.3.1 称取0.36 mg 琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4 ml DEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60℃空气浴平衡溶液 需加DEPC水补充蒸发的水分 4.3.2 在通风厨中加入3.6 ml的10Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。注意尽量避免产生气泡。 4.3.3 将熔胶倒入制胶板中，插上梳子如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒或其它方法去除，或将气泡推到胶的边缘。注：胶的厚度不能超过0.5 cm。 4.3.4 胶在室温下完全凝固后，将胶转移到电泳槽中，加1MOPS Gel Running buffer盖过胶面约1cm，小心拔出梳子。（配制250 ml　1MOPS Gel Running buffer，在电泳过程中补充蒸发的buffer。） 4.3.5 检查点样孔。 4.4. RNA样品的制备 在RNA样品中加入3倍体积的formaldehyde load dye和适当的EB（终浓度为10ug/ml）。混匀后，65℃空气浴15 min。短暂低速离心后，立即放置于冰上5 min。 4.5 电泳： 4.5.1 将RNA样品小心加到点样孔中。 4.5.2 在5 V/cm下跑胶（514cm）。在电泳过程中，每隔30 min短暂停止电泳，取出胶，混匀两极的电泳液后继续电泳。当胶中的溴纷蓝（500bp）接近胶的边缘时终止电泳。 4.5.3 紫外灯下，检验电泳情况，并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离。注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间。 4.6. 转膜 4.6.1 用3%双氧水浸泡真空转移仪后，用DEPC水冲洗。 4.6.2用RNAZap擦洗多孔渗水屏和塑胶屏，用DEPC水冲洗二次。 4.6.3 连接真空泵和真空转移仪，剪取一块适当大小的膜（膜的四边缘应大于塑胶屏孔口的5 mm），膜在Transfer buffer浸湿5分钟后，放置在多孔渗水屏的适当位置。 4.6.4 盖上塑胶屏，盖上外框，扣上锁。 4.6.5 将胶的多余部分切除，切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔，并至少盖过边缘约2 mm，以防止漏气。 4.6.6 将胶小心放置在膜的上面，膜与胶之间不能有气泡。 4.6.7 打开真空泵，使压强维持在50~58 mbar；立即将transfer buffer加到胶面和