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慢冻程序 标准程序： 当温度在-25 ℃以上时， 1～2 ℃/min 当温度达-25 ℃以下时， 5～10 ℃/min 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中 细胞冻存器 简易程序： 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2 ℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。 低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在细胞外形成冰晶，减少细胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。 细胞冻存方法 预先配制冻存液： 含20%血清培养基 10% DMSO 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml) 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期 细胞复苏方法 从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38 ℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。 5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。 低速离心10分钟。 去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。 细胞计数 血细胞计数板 计数仪 Counter 血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber?中细刻9?个1?mm2大正方形，其中4?个角落之正方形再细刻16?个小格，深度均为0.1?mm。当chamber?上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1?mm2?x?0.1?mm=1.0?x?10-4?ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml?中之细胞数目。 培养细胞活力测定 台盼蓝法，trypan?blue，?利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力 MTT法 转染 (Transfection) 将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能 常特指将质粒或以它们为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。 转染和转化的区别 转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。 瞬时转染和稳定转染 瞬时转染，外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但 通常只持续几天。一般来说，在转染后24-96小时内检测和分析结果。 稳定转染，也称永久转染，外源DNA整合到宿主染色体中。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过选择性标记筛选，如抗生素筛选APH（新霉素抗性基因）， HPH （潮霉素）， TK（胸苷激酶）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。 影响转染效率的因素 细胞培养物 健康的细胞 低的细胞代数（50）能确保基因型不变 一定的细胞密度 推荐在转染前24小时内分细胞，这将提供正常细胞代谢，增加对外源DNA摄入的可能 血清 血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差别。血清质量的变化直接影响转染效率。 有些转染技术如脂质体转染在有血清存在情况下效率很低，因此在转染前要除血清。 DNA质量 一般的转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引原理，如果DNA不纯，如带少量的盐离子、蛋白、代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。核酸纯化世界第一品牌德国QIAGEN公司提供的超纯质粒抽提试剂盒，能达到两倍2xCsCl梯度离心以上的纯度效果，使DNA质量得到保证。 对一些内毒素敏感的细胞（如原代细胞，悬浮细胞和造血细胞），QIAGEN还提供可去除内毒素污染的质粒抽提试剂盒，在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子，保证理想的转染效果。 6孔板转染实验步骤 转染前18至24小时内接种2×105细胞至每孔内（细胞浓度1×105/ml，每孔接种2ml，全培养基培养，无抗生素），转染前4小时更换培养基 对每孔细胞，稀释2ug DNA于250 ul OptiMEM 对每孔细胞，稀释4 ul Lipofectamine 2000于250 ul OptiMEM，室温孵育 5 min 将步骤2和步骤3中的DNA悬液和 Lipofectamine 2000 悬液均匀混匀，室温孵育20 min以使 DNA- Lipofectami