WesternBlot黄强开详解.ppt

* 脱脂奶粉（5％） BSA(牛血清白蛋白)可能有封闭不均匀的情况 室温1小时 封闭膜上的空白位点 －－封闭:室温1h 或 4℃过夜 －－TBS洗涤5min x 3次 一抗 购买时 五注意 注意种属(rat mouse rabbit )， 注意特性（单抗、多抗） 注意用途（免疫荧光 组化） 注意品牌（Abcam Sigma CST life Santa） 操作 : 严格无菌防污染 可分装保存 稀释浓度: 经验 文献 封口袋摇床上缓慢摇动 37 ℃ 1h 或 4℃过夜, TBS洗涤5min x 3次 （一抗中有叠氮钠，洗涤时间及次数增加） 二抗 看种属 （羊抗兔 兔抗鼠） 看用途 （HRP 荧光） 看价格 （国产品牌已能胜任 博士德 中杉 看品牌 但实验室买进口包装更划算） 操作: 封口袋摇床上缓慢摇动或 倒扣法孵育 37 ℃ 1h TBST洗涤5min x 3次 大分子量蛋白 6%-8% 的胶 延长胶平衡时间 增加转膜时间 提高电压或电流 但要注意温度 小分子量蛋白 12%-15%的胶选小孔径的膜 0.22um 缩短时间 降低电压或电流 浸泡膜时间小于10min （0.45μm也可用于小分子量，0.22μm背景偏深） 一抗: 4oC 过夜 二体: 1 -3 hours 室温 抗体孵育和检测 HRP 膜上目的蛋白 一抗 二抗 3-aminophtalate (光敏感的) 底物 eg Hydrogen peroxide + luminol 漂洗3遍后 从封闭开始，做其他抗体 ECL的A液（化学发光增强剂）和B液（H2O2）在HRP催化下发出荧光，不消耗HRP，但HRP常温放置时间过长会降解。 （DAB, ECL） Western Blot 结果 追踪蛋白去向 胶——考马斯亮蓝 膜——丽春红 * 转膜之前——转膜过程——转膜之后 1、胶+，膜+ 2、胶+，膜- 3、胶-，膜- 胶-，膜+ 胶-，膜- WB实验原则 设置合适的对照： 阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率 阴性对照：明确不表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的特异性 二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性 内参对照：检测标本的质量和二抗系统、进行半定量 空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果 Western Blot常见问题分析 * 电泳条带 笑脸状——凝胶不均匀冷却，中间冷却的不好，电泳系统温度偏高。 灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓，拔梳子要迅速，以免把上样带扭曲，降温。 皱眉状——胶板底部有气泡，或两边聚合不完全。 * 拖尾——样品溶解不好。制样后冷藏的样品上样前需解冻完全。 纵向条纹——样品有不溶性颗粒。 偏斜条带——电极不平衡或加样位置倾斜。 波浪条带——散热不好。 * 条带两边扩散——1、浓缩胶凝固时间过短，梳子和槽没有充分凝固。2、上样时枪头使劲深入加样孔使薄板和厚板之间有间隙。3、加样时蛋白吹到隔壁。4、条带跑的太低。5、浓缩胶过高（推荐1cm）蛋白被过度压缩。 弥散型条带——1、上样量太多。2、抗体浓度太高 * * 上样量过大（一般为20-30μg，至少10μg） 一抗/二抗浓度过大 * 高背景 抗体浓度过高——优化/降低一抗二抗浓度。 封闭液不合适——比较不同封闭液。 封闭不完全——1、封闭液的选择。2、增加封闭液的蛋白浓度。3、优化封闭时间。 抗体与其他蛋白交叉反应——1、更换封闭液。2、降低二抗浓度。 * 洗涤不完全——增加洗涤次数和时间 曝光时间过长——缩短曝光时间 缓冲液污染——更换缓冲液 * 斑点状高背景 抗体浓度过高——优化降低抗体浓度。 二抗聚集——更换二抗。 封闭不完全——同前 抗体与其他蛋白发生交叉反应——同前 膜没有正确湿润 缓冲液污染 仪器污染——有残留胶 * * 无信号或信号弱 转膜不完全——1、染胶确定转膜效率 2、保证膜和胶充分结合。3、确保电极正确，滤纸—膜—胶—滤纸。4、正确湿润膜。5、防止电转过热。6、优化电转时间。7、使用Marker。 蛋白和膜结合不充分——1、缓冲液补充甲醇。2、更换小孔径膜。 抗体——1、抗体失效。2、增加抗体浓度。3、抗体结合能力差。 * 抗原不足或降解——增加上样量。 抗原降解——重新制样，新配蛋白抑制剂 缓冲液里有叠氮钠——叠氮钠抑制HRP活性，更换缓冲液 曝光时间短 底物孵育时间短 荧光增强剂失效 * 非特异条带 交叉反应 抗原浓度太高——降低浓度 抗体浓度太高——降低浓度 非特异性吸附——转膜后清洗