SSCP实验步骤.docVIP

SSCP实验步骤 聚丙烯酰胺凝胶的制备 一般情况下，用12%的聚丙烯酰胺凝胶分离待测片段。根据玻璃板规格的不同（1.0、1.5两种），分别配制7ml、10ml的胶，配方如下表： 7ml（1.0板） 10ml（1.5板） 配方 H2O 3.43 4.93 Acr/Bis 2.1 3 40% (Acr29:Bis1) 5×TBE 1.4 2 54.0gTris+27.5g硼酸+4.65g EDTA定容至1L，PH约8.3 AP 0.070 0.070 10%过硫酸铵：1g过硫酸铵融入10ml水中，冷藏 TEMED 0.005 0.005 1%四甲基乙二胺：聚合加速剂 备注：1 配胶前将玻璃板洗干净，擦干 2 标号为2的电泳槽有时接触不良，不提倡用其做SSCP 3 待30min后，胶凝固，用保鲜膜包好放冰箱冷藏 4 标着“坏”的制胶器，只能用于制1.5规格玻璃板的胶 样品的制备 设计引物，样品片段长度一般因在150-300bp之间。 PCR扩增目的片段，琼脂糖凝胶检测。 样品稀释。根据琼脂糖凝胶检测结果，如果PCR产物很浓（与marker一样亮），则将PCR产物稀释3倍；若PCR产物浓度较弱，则可以不稀释。 取1 μl 稀释好的PCR产物，加入9ul 变性缓冲液中，混匀。 变性缓冲液：溴酚蓝5mg，0.5M EDTA. Na2 (pH8.0 ) 400μl，甲酰胺9.6ml，混匀。 变性 开启PCR仪，将程序设置为98 ℃ 11min 将混有甲酰胺的样品放入PCR仪中，开始变性 准备冰盒 当变性10min时，打开PCR仪，迅速将样品插入冰中，保持10min 上样电泳 电泳前，所用的胶，电泳缓冲液（1×TBE）都要先预冷。 取样品3μl，依次点到事先制好并且制冷的聚丙烯酰胺凝胶中。点样时注意标准品不要点到胶的最边上两个孔，以免由于制胶不均匀或其他原因造成的标准品分型不好，起不到指示作用。 将电泳槽放到4 ℃ 冰箱中，连上电泳仪，250V跑10min，50V 16h 注：电泳条件因待分离片段的不同而不同，因此若以上条件不能够将不同的基因型分开，则可以尝试其他的条件。 染色 1、固定。把胶卸下，做好起始记号，放入约80ml固定液（50ml无水乙醇，2.5ml冰乙酸，定容到500ml，冷藏）中在摇床上固定10min。 2、染色。60ml染色液（0.75gAgNO3，溶入500ml水中，避光保存）+60μl甲醛， 染色6min。蒸馏水洗涤一次。 3、显色。60ml显色液（7.5g NaOH，溶于500ml水）+120μl甲醛，放到摇床上显色至条带清晰。倒掉显色液，加蒸馏停止显色。 注：做完实验后样品，实验器材都要及时放回原位，银染用的器材要清理干净。