CNPS循环主要相关酶酶活测定.docVIP

C、N、P、S循环主要相关酶酶活测定 林叶春 2010-01-05 A. 芳基酰胺酶(Arylamidase，EC3.4.11.2) 1g土样 -试剂： 0.1M pH8.0Tris缓冲液[2.44g三羟甲基氨基甲烷溶于50ml去离子水中，用0.05M H2SO4调节pH至8.0，再用去离子水定容至200ml]；0.05M H2SO4；L-亮氨酸-β-萘胺溶液[称取0.2342g L-亮氨酸-β-萘胺盐酸盐溶于适量去离子水中，并定容至100ml，即为8.0mM溶液]；盐酸化乙醇[将4.32ml浓盐酸加入到适量95%的乙醇中，并用乙醇定容至200ml，即为盐酸化乙醇]；4-二甲基氨基肉桂醛(CAS:6203-18-5)溶液[称取0.12g 4-二甲基氨基肉桂醛溶于95%乙醇中，并用乙醇定容至200ml，即为0.6mg/ml的溶液]；β-萘胺标准溶液[称取12.5mg β-萘胺于100ml容量瓶中，加入5ml乙醇和75ml去离子水，充分摇匀，再用去离子水定容至100ml，即为125μg/ml的β-萘胺标准溶液]。 -仪器：分光光度计(540nm)；25ml三角瓶；摇床；培养箱；离心机；试管 -操作：取1.0g新鲜土壤(2mm)于25ml三角瓶中，加入3ml 0.1M pH8.0 Tris缓冲液和1ml 8.0mM L-亮氨酸-β-萘胺溶液，盖上瓶塞，充分混匀，于37℃培g离心1min，将上清液转移至试管中。取此上清液1ml于另一支试管中，加入1ml乙醇、2ml盐酸化乙醇和2ml 4-二甲基氨基肉桂醛溶液，充分混匀，于540nm处比色测定。对照样，在培养结束之后再加入1ml8.0mM L-亮氨酸-β-萘胺溶液。 -校准曲线制作：分别量取1，2，3，4，5和6 ml 125μg/ml β-萘胺标准溶液于25ml的容量瓶中，用去离子水定容，即得5，10，15，20，25和30μg/ml β-萘胺工作溶液。取上述工作液各1ml于试管中，分别加入1ml95%乙醇、2ml盐酸化乙醇和2ml 4-二甲基氨基肉桂醛溶液，摇匀后于540nm处比色。 -结果： 芳基酰胺酶活性(μg β-萘胺·g-1·h-1) = CV/(dwt×t) 其中，C为样品β-萘胺含量(μg/ml)；V为土壤溶液体积(ml)；dwt为烘干土壤质量(g)；t为反应时间(h)V. Acosta-Martínez and M. A. Tabatabai. Arylamidase activity of soils. Soil Sci. Soc. Am. J. 2000,64:215-221. B. β-葡糖苷酶(β-glucosidase，EC3.2.1.21) 1g土样 -试剂：甲苯；pH值6.0MUB缓冲液；0.5mol/L NaOH；0.5mol/L CaCl2溶液；p-硝基酚标准溶液[参见磷酸酶测定]；pH12.0Tris缓冲液[12.2g三羟甲基氨基甲烷β-D-葡糖苷(PNG)溶液[0.377g PNG溶于40ml MUB缓冲液中，用相同的缓冲液稀释至50ml，在4℃下贮存]；去离子水 MUB缓冲液(Modified Universal Buffer Solution): 12.1 g三羟甲基氨基甲烷（THAM）11.6 g顺丁烯二酸，14.0 g柠檬酸和6.3 g硼酸（H3BO3）于ml 1 mol·L-1 NaOH溶液中，再用水稀释至1L，贮于冰箱中1.改进的MUB(H6.0):取200ml储备液于配有磁力搅拌器的500ml烧杯中，滴入0.1N的HCl搅拌至H6.0,水定容至1L. 2.改进MUB(pH11):取200ml储备液于配有磁力搅拌器的500ml烧杯中，滴入0.1NNaOH的搅拌至H11,水定容至1L. 37℃培g10 min，上清液在400nm处比色测定。做空白对照时，必需在培养结束之后，加CaCl2溶液和Tris缓冲液之后加入底物PNG溶液。每个样品必需做一个空白和三次重复。 -标准曲线制作：取1ml对-硝基酚标准溶液于100ml容量瓶中，用去离子水定容至刻度，再分别取该稀释液0，1，2，3，4和5ml于50ml三角瓶中，用去离子水调节溶液体积至5ml(即为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0μg/ml的对-硝基酚工作液)，然后加入1.00ml0.5M CaCl2溶液和4.00ml 0.5M NaOH溶液，充分混匀后迅速过滤，同上比色测定。 -结果： β-葡糖苷酶活性(μg对-硝基酚·g-1·h-1) = CV/(dwt×t) 其中，C为样品对-硝基酚含量(μg/ml)；V为土壤溶液体积(ml)；dwt为烘干土壤质量(g)；t为反应时间(h)Tabatabai M.A.,1994.Enzymes. In: Weaver,