Taq酶提取protocal.docVIP

Rapid Purification of High-activity Taq DNA Polymerase 本次试验历时六天，分为准备工作（两天），酶的诱导表达（一天），酶的提取（一天），酶的透析以及酶的保存（两天）。下面按时间顺序叙述。 第一天 准备工作 （1）清洗器皿。 100ml量筒：3－4个 1000ml量筒：1－2个 500ml量筒：2－3个 250ml量筒：1个（没有亦可） 1000ml烧杯：2个 小烧杯：2个 500ml三角瓶：1个 150ml三角瓶：2－3个 500ml离心管：4个 250ml离心管：2or4个 50ml离心管：12or6个 10ml移液管：5－6个 药勺：3－4个 透析袋+超纯水（灭菌） 透析夹+超纯水（灭菌） 细菌滤+滤膜（灭菌，切勿烤干！） 枪头（1ml1－2盒，0.2ml2盒） 小管（1.5ml1瓶，灭菌） 定性滤纸：两包 新的10ml离心管：灭菌，保存酶用。 磁转子：蒸馏水洗，不必灭菌。 同时准备一大瓶超纯水备用。 Note： （一）整个清洗过程都要戴手套（干燥后操作要戴PE手套）。 （二）器皿最后都要用超纯水润洗，倒放在滤纸上干燥。包上牛皮纸灭菌。 （三）离心管干燥后封口灭菌。 （四）药勺用盐酸处理除去污渍锈斑，灭菌。 （2）配LB培养基。（按照分子克隆实验指南配方）2L灭菌。预备明晚摇菌。 （3）菌种活化，划单斑。 取98.11的DJP菌种划单斑，37℃培养，预备明晚摇菌。 Note： 提取Taq酶每次只用上次保存的菌种，每次摇菌后都要保存菌种！ PROCEDURAL EXPLANATION：作蛋白表达的细菌和感受态细菌都要经过转瓶活化过程。 第二天 准备工作 （1）将昨晚划的平板放在4℃预备晚上摇菌。 （2）配溶液Buffer A，Lysis Buffer，Storage Buffer并灭菌。 Buffer A： 50mM Tris－HCl pH7.9 50mM Dextrose 1mM EDTA－K+ 配法：（FOR 400ml induce Pre－Lysis Buffer） 1M Tris－HCl（pH7.9） 20ml 0.5M EDTA－K+（pH7.9） 0.8ml Dextrose 3.6g 加超纯水至390ml，pH计调至7.9，定容至400ml。 Note： （一）pH值要在7.9以上，7.910以下。（用KOH和HCl调） （二）最后酶要悬浮在Buffer A中，因此要用超纯水。其他缓冲液用蒸馏水即可，也可用超纯水。 Lysis Buffer： 10mM Tris－HCl （pH7.9） 50mM KCl 1mM EDTA－K+（pH7.9） 0.5%（v/v）Tween-20 0.5%（v/v）NP40 1mM PMSF（用前再加） 配法：（FOR 200ml） 1M Tris－HCl（pH7.9） 2ml 0.5M EDTA－K+（pH7.9） 0.4ml 1M KCl 10ml 10% Tween－20 10ml 10%NP40 10ml 灭菌后加入PMSF 0.03484g。（以约300－500μl异丙醇溶解，缓慢加入） Note：PMSF可用异丙醇溶解后缓慢加入，也可直接将粉末倒进去剧烈振荡。（PMSF剧毒，注意防护） Pre－Lysis Buffer：即Buffer A中加Lysozyme至4mg/ml。（现配现用） 1×Storage Buffer：（200ml，溶解酶用，-20℃保存） 50mM Tris－HCl（pH7.9） 0.1mM EDTA－K+ 50mM KCl 0.5mM PMSF 1mM DTT 配法： 1M Tris－HCl（pH7.9） 10ml 0.5M EDTA－K+（pH7.9） 0.04ml 1M KCl 10ml PMSF 0.01743g 定容至100ml，再加甘油100ml。灭菌后加入过滤除菌的DTT。 1M DTT过滤除菌后加入0.2ml，即终浓度为1mM（配法：1.543g→10ml超纯水或0.7715g→5ml超纯水，过滤后小管分装。-20℃保存） Note： （一）PMSF可用异丙醇溶解后缓慢加入，否则易析出。 （二）DTT易降解，因此要在Buffer灭菌后加入，并且在低温保存。 1×Storage Buffer：（2L透析用） 50mM Tris－HC