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DNA粗提取与鉴定实验12问 青岛二中生物教研组?? 曹晖? ?????? DNA粗提取与鉴定实验是高中生物教学中难度最大步骤最复杂的实验，也是一个可操作既有趣又有意义的实验。本人根据该实验的原理与步骤，结合指导学生完成本实验的教学实践和学生在实验操作中易发生的问题，设问12项并作答如下：? 1、DNA粗提取的原料是鸡血细胞，可否用其他动物的血细胞替代？答：本实验粗提取的DNA来自鸡血细胞核里的DNA，只能用鸟类的血细胞替代。不可用哺乳动物的血细胞，因为哺乳动物的血细胞无细胞核。? 2、为什么要对新取来的鸡血液及时加入抗凝剂并搅拌？答：新鲜血液加入抗凝剂（质量浓度为0.1g/ml的柠檬酸钠溶液）并搅拌，使血液与柠檬酸钠充分混合。防止血细胞凝集成团，影响血细胞的破碎和对血细胞里DNA的提取。? 3、加入了抗凝剂的血液，为什么要在实验前一天放入冰箱（冷藏）或用离心机进行离心？答：放入冰箱冷藏或离心的目的都是为了沉降血细胞。因为鸡血细胞与鸡血液的体积之比为1：3，沉降了血细胞之后，可除去上层约占2/3体积的血浆。在剩下的鸡血细胞液里，血细胞的相对数量增多，从中可提取的DNA物质会相对多一些。? 4、如何使鸡血细胞核里的DNA释放出来？答：首先对5~10ml鸡血细胞液加20ml蒸馏水，使血细胞在低渗环境里吸水膨胀，再加上快速搅拌的机械作用，加速了鸡血细胞细胞膜、核膜的破碎，细胞核里的DNA（实为结合着蛋白质的核蛋白）就释放出来了。用一层纱布过滤，除去细胞膜等较大的杂质，收集滤液。这是本实验的关键步骤之一，没有细胞核里DNA的释放，就没有实验结果，所以必须保证快速用力搅拌且时间在5min以上。? 5、DNA被粗提取的原理是什么？答：在较高浓度的NaCl溶液（2mol/L）里，核蛋白解聚。随着NaCl溶液浓度的降低，DNA的溶解度降低，蛋白质的溶解度增大。所以，要对上述含有核蛋白的滤液加入40ml浓度为2mol/L的NaCl溶液，经搅拌使DNA在溶液里呈溶解状态，初步分离DNA与蛋白质。?????? DNA在NaCl浓度为0.14mol/L时，溶解度最小而被析出。所以，对已溶解有DNA的溶液缓缓地加入蒸馏水，使含DNA的NaCl溶液浓度逐渐降至0.14mol/L（约需加入300ml蒸馏水）。用玻棒缓缓搅拌（玻璃有吸附DNA的作用），此时DNA以粘稠物状析出。三层纱布过滤，即可得到含DNA的粘稠物。这是本实验的关键步骤之二。?????? DNA不溶于酒精，尤其冷却酒精更易使DNA发生凝集，而蛋白质等物质都溶于酒精。根据此原理可将DNA与蛋白质分离，并从NaCl溶液里将DNA提取出来。? 6、在得到了含DNA的粘稠物时，为什么还要将此粘稠物再次溶于2mol/L的NaCl溶液中？答：这是一次对DNA的粗提纯，使最后得到的DNA更纯一些、杂质更少一些。所以，要用钝头镊子将纱布上的粘稠物尽可能多的刮下，再次溶于2mol/L的NaCl溶液中。两层纱布过滤，除去杂质，取其滤液。? 7、当析出的含DNA的粘稠物很少或没有析出时，有补救措施吗？答：没有含DNA的粘稠物析出，就等于没有实验结果而前功尽弃。此时应将没有粘稠物滤出的滤液重新倒回大烧杯，或继续缓缓加入蒸馏水或先加入少量2mol/L的NaCl溶液再缓缓加入蒸馏水（前一种情况更多见，是学生急于过滤所致；后一种情况是学生加蒸馏水过快、过多，错过了0.14mol/L浓度值所致），重新调整NaCl溶液的浓度直到（0.14mol/L）有较多的含DNA的粘稠物析出时为止。? 8、本实验共有七次搅拌，除第一次加抗凝剂的搅拌和第二次加蒸馏水使血细胞破碎的搅拌外，其余五次搅拌均要求沿一个方向轻搅。为什么？答：因为自血细胞破碎后，就有大分子DNA物质进入了溶液。沿一个方向轻搅是为了保持DNA分子的完整性。最后提取到的DNA是以细丝状的形式缠绕在玻棒上。可以想象不是同一方向的乱搅就不会有这一结果了。? 9、如何用纱布做好三次过滤？答：本实验要用纱布做三次过滤，因每一次过滤的目的不同，所用纱布的层数也不相同。可在实验前准备一块手帕大小的纱布并蘸湿，根据过滤的需要进行不同层数的折叠。??????? 第一次为提取鸡血细胞液的细胞核物质而进行的过滤。因为鸡血细胞的细胞核物质已释放入溶液了，所以此次过滤的目的是取滤液、除去细胞膜等杂质。用一层纱布过滤。??????? 第二次为得到含DNA的粘稠物而进行的过滤。DNA在NaCl溶液浓度为0.14mol/L时，溶解度最小而以粘稠物的形式析出。所以此次过滤的目的是取滤出物（含DNA的粘稠物），除去滤液的。用三层纱布过滤。??????? 第三次为得到相对较纯的DNA而进行的过滤。为了对含DNA的粘稠物进行提纯，将含DNA的粘稠物再次溶入2mo