11第十一章 核酸体外扩增课件.pptVIP

第一节 聚合酶链反应 polymerase chain reaction ,PCR 一、PCR的基本原理 PCR的基本原理 示意图 二、PCR引物设计原则 PCR引物设计原则要点 1. 长度为15~30个核苷酸 2. 碱基随机分布，G+C的含量为45~55% 3. 避免发夹结构的形成，引物的存在连续互补序列不超过3bp 4. 引物之间不应存在互补序列，避免3 ′端互补重叠 5. 引物的碱基序列与非扩增区域无同源性 6. 引物3 ′端碱基一定与模板配对，最佳碱基选G和C 7. 引物5 ′端可以修饰，如加酶切位点，突变位点，起始密码子，终止密码子等。 三、模板制备 （二）RNA模板的制备 1. RNA提取试剂盒 2. 酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法 3. 异硫胍氯化铯密度梯度分离法 4. SDS-酚-氯仿法 （三）模板的取材 模板（PCR样本）可来源于病原微生物，组织细胞，血迹精斑，羊水尿样等。关于模板DNA或RNA制备请参看实验讲义。 1. 病原体标本：病毒、细菌、真菌、螺旋体、立克次体、支原体等 2. 病理生理标本：细胞、血液、绒毛、尿液等 3. 法医学标本：血斑、精斑、毛发 4. 考古标本 四、PCR的基本反应 五、PCR反应条件的控制（PCR条件的优化） 102-105拷贝的靶序列 六、PCR实验中应注意的事项 第二节 PCR技术的扩展 二、筑巢法PCR 九、锚定PCR （anchored PCR 以mRNA为模板经RT合成cDNA，末端转移酶在cDMA3′末端加上poly dG 尾。Poly dC 锚定引物与poly（dG 尾互补结合引导合成未知DNA序列 十、原位PCR（in situ PCR） 固定组织细胞内的DNA或RNA，以其为模板进行PCR反应的过程 十二、差异显示PCR（differential display PCR） 1. 将两种mRNA逆转录为cDNA第一链 2. 加入锚定引物，随机引物 3. PCR扩增，以扩增引物代表相应mRNA 4. 分析两种基因表达的差异 十三、重组PCR（recombinant PCR） PCR参与的体外基因突变或基因融合过程 十四、PCR技术的应用 （一）遗传性疾病的基因诊断，例地贫的产前诊断。 （二）检测癌基因 PCR与寡核苷酸探针杂交结合检测ras基因点突变 PCR扩增包含ras基因12、13和61位密码子的DNA片段 寡核苷酸探针与PCR产物杂交 放射自显影，检测点突变发生的类型和部位 （三）检测病原微生物 PCR检测HIV、HBV、巨细胞病毒、人乳头状瘤病毒、肠道病毒、肺炎支原体等。 （四）PCR在法医学上的应用 亲子鉴定 个体识别 （五）PCR技术在分子生物学中的其它应用 DNA克隆 重组PCR 引入点突变，缺失或插入 DNA序列测定 双链克隆后测序:双链PCR产物加热变性为单链，与某一个方向的引物退火，用双脱氧链终止法可测定一定长度的DNA序列 基因扩增转录测序:在PCR时，使用1个5′带T7启动子序列的引物，T7RNA聚合酶以扩增产物为模板合成mRNA,然后以mRNA为模板，用逆转录酶进行测序 不对称PCR产生单链测序：用两种不同浓度的引物进行PCR反应，当低浓度引物耗尽时，高浓度引物介导合成单链DNA，然后以单链DNA为模板用双脱氧链终止法测序 （五）dNTPs （六）缓冲液 储备dNTP液具有较强的酸性，应以NaOH将PH调至7.0-7.5，分装-20℃保存，避免过多冻融会使dNTP降解。其浓度为20-200μmol/L，高，增加错误掺入率，加快反应，低，提高实验精确性，使反应速度下降。 目前最为常用的缓冲液组成为10-50 mmol/Ltris-Hcl（PH8.3室温，72℃PH7.2），50mmol/LKcl,1.5mmol/LMgcl2。Tris是双极性离子缓冲液，20℃Pka8.3，在实际PCR变化在6.8-7.8之间，加大Tris浓度（如至50mmol/L），改变反应液缓冲能力（PH8.9），有时会增加产量。50mmol/L以内Kcl有利于引物退火，大于此浓度则抑制酶活性，加入BSA、DTT（明胶或Tween20）有助于酶稳定。 （七）温度循环参数 1、变性温度和时间 一般94-95℃30-60s可使各种复杂DNA分子完全变性（变性不完全会导致PCR失败），过高，时常会影响Taq酶活性，简单办法先变性，如97℃7-10min，再加酶，过低过短时间，变性不完全。 2、复性（退火）温度与时间 复性温度决定PCR的特异性，一般为45-55℃，低，易退火，但特异性低；高，退火较难，但特异性高。引物复性温度和时间取决于引物碱基组成，长度。扩增引物在PCR条件下真实Tm值-5是合适的复性温度，Tm 4（G+C）+2（A+T）（Tm-A26