第二十一章免疫学方法技术课件.pptVIP

第21章 免疫学方法技术 第一节基于Ag-Ab反应的检测方法 抗原-抗体反应：指抗原与相应抗体在体内、外发生高度特异性结合反应。由于实验所用的抗体存在于血清中，故又称血清学反应（serological reaction) 用于：抗原（微生物、细胞、激素、细胞因子、肿瘤标志物等）、抗体的检测。 特异性 抗原抗体反应的可见性 适当的比例和浓度 可逆性 一、凝集反应（agglutination reaction） 概念：细菌、细胞等颗粒性抗原或包被有抗原的颗粒状物质（如聚苯乙烯乳胶等）与相应的抗体结合，出现肉眼可见的凝集团，称为凝集反应。 1、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法和试管法。 2、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。 二、沉淀反应（precipitation） 概念：可溶性抗原（免疫球蛋白、细胞裂解物、组织浸液等）与相应抗体结合， 形成不溶性免疫复合物，出现不透明的沉淀物。在液体中进行出现絮状沉淀，在半固体琼脂凝胶上进行，形成白色的沉淀。 4、免疫比浊 三、补体参与的反应 第二节 免疫标记技术 免疫标记技术（Immunolabelling technique） 概念：用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。标记物质未改变抗原抗体的免疫学特性，同时标记物极大的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。 免疫标记技术主要有三种基本类型：免疫荧光技术、免疫酶技术和同位素标记技术。 一、免疫荧光法(immunofluorescence,IF) 概念：荧光素标记的抗体（抗原）与组织或细胞中的相应抗原（抗体）结合，借助于荧光显微镜或流式细胞仪对抗原（抗体）进行鉴定或定位。 （1）直接荧光法：荧光素直接标记抗体，对标本进行检测。该法优点是特异性高，缺点是检查任一抗原均须制备相应荧光抗体。 （2）间接荧光法：用一抗与标本中抗原结合，再用荧光素标记的二抗进行检测。该法优点是敏感度比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗即可用于多种抗原的检测,但非特异性反应亦增强。 流式细胞仪的细胞分析原理 待测细胞被制成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后加入样品管中，在气体压力推动下进入流动室。 流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排成单列出流动室喷嘴口，并被鞘液包绕形成细胞液柱，进入流动室。 被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照时后发出荧光，被荧光光电倍增管接收，实现了细胞的定量分析。 再通过流束形成含有细胞的带电液滴而实现了细胞的分选。 二、酶免疫测定(enzyme immunoassay, EIA) 概念：是用酶标记的抗体进行的抗原抗体反应。将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，借助酶作用于底物的显色反应判定结果。 常用的酶为： 辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酯酶（AP） 常用的方法如下： （1）酶联免疫吸附试验 测定可溶性抗原或抗体 （2）免疫细胞或组织化学 测定组织中或细胞表面的抗原 1. 免疫细胞或免疫组化技术 概念：应用酶标记的抗体与组织或细胞抗原发生反应，结合形态学观察，对组织或细胞表面抗原进行定性、定量、定位。 2.酶联免疫吸附试验 (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 基本原理：是将过量抗体（抗原）包被于载体（聚苯乙烯微量反应板）上，通过抗原抗体反应使酶标记抗体（抗原）也结合在载体上，经洗涤去除游离的酶标记抗体（抗原）后，加入底物显色，定性或定量分析有色产物确定待测物的存在与含量的检测技术。 是酶免疫测定中应用最广的技术，用于测定可溶性抗原或抗体。 1. 双抗体夹心法 用于检测特异性抗原。 方法：将已知抗体吸附于固相载体．加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。 该试验所用的包被抗体与酶标抗体应分别针对不同抗原决定基，或其中之一用多克隆抗体，且相互间应无交叉反应。 2. 间接法 用于检测特异性抗体。 方法：将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。 3. 竞争法 用于抗原和半抗原（抗原决定簇少）的定量测定，也可用于测定抗体。 方法：以测定抗原为例．将持异性抗体吸附于固相载体；加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竞争与固相抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。 ELlSA方法的技术要点 I 与固相载体结合的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被(coating)，由于载体不同，包被的方法也不同。 使用聚