第四章抗体制药456节课件.pptVIP

第四节 基因工程抗体和抗体工程 抗体研究进展3个阶段： 　①1890年Behring发现白喉抗毒 素，特点：多克隆抗体； 　②1975年Kǒhler创建杂交瘤技术制备单克隆抗体； 　③1994年Winter基因工程方法制备抗体。 Winter等人建立了噬菌体抗体库，克服了人体不能随意免疫的缺点，用人的外周血制备抗体文库，获得了人源性基因工程抗体。 在此之前，基因工程抗体技术只能对已有的单体进行改造，而抗体库技术的诞生却可以不通过动物免疫和细胞融合便可以从抗体库中筛选得到全新的人源化的抗体，并通过细菌发酵或转基因动植物生产出来。抗体库技术的发展使得抗体工程技术进入了一个全新的时期。 抗体库技术的生产与发展基础在于两项关键技术的突破，一是PCR技术的应用使得人们可以利用一组引物扩增出全套免疫球蛋白的可变区的基因；二是从大肠杆菌中直接表达出有功能活性的抗体分子片段。基因原理是将某种动物的所有抗体可变区的基因克隆在质粒或噬菌体载体中进行表达，分泌，然后通过特定的固相化抗原便可筛选出高度特异性抗体基因的克隆。该抗体库又称全套抗体库或组合抗体库。 用基因工程的方法可以将抗体基因的克隆和表达融为一体，同在一种载体上进行，将抗体基因表达在载体的表面，用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛，在数日内就可筛选出阳性克隆。 一、噬菌体抗体库技术的基本方法 ⒈ 获取目的基因（RT-PCR） ⒉ 抗体库技术的载体（噬菌粒phagemid为载体） 具有噬菌体与质粒特点、转化效率高、库容量大 ⒊ 淘筛抗原固相化后，对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增。 ⒋ 表达与鉴定 （Western blot） 噬菌体抗体库的技术流程 二、噬菌体抗体库技术的特点 ⒈ 模拟天然全套抗体库 抗体文库可以达到或超过1011库容，所以能包含B细胞全部克隆 ⒉ 避开了人工免疫和杂交瘤技术 可以调出任意抗体基因 ⒊ 可获得高亲和力的人源化抗体 抗体基因来自人体 三、基因工程抗体表达 ⒈ 原核细胞表达（大肠杆菌） ⒉ 真核细胞表达 （酵母菌） ⒊ 转基因植物表达（烟草） ⒋ 转基因动物表达（鼠） 第五节 抗体诊断试剂 一、血清学鉴定用的抗体类试剂 血清学鉴定是指用已知抗体来鉴定未知的抗原型，主要用于疾病的病原菌的诊断和血型鉴定。常用的方法是凝集反应。 ⒈ 鉴定病原菌的抗体试剂 ⑴ 常用诊断血清的品种和用途 ①沙门氏菌属诊断血清 ②志贺氏菌属诊断血清 ③病原性大肠埃希氏菌诊断血清 ⑵ 诊断血清的制备步骤 　①制备细菌抗原 　②免疫动物和制备抗体血清 ⑶ 诊断血清诊断方法—直接凝集反应 ⒉ 乙型肝炎病毒表面抗原的 反向被动血凝诊断试剂 ⒊ 妊娠诊断试剂 ⒋ 抗ABO血型系统血清 二、免疫标记技术用的抗体类试剂 能将抗原抗体反应放大，使常规方法不能观察的反应得以显现，因而大幅度提高抗原抗体反应的敏感性，用于对微量抗原物质进行定性或定量检测。 ⒈ 荧光抗体诊断试剂 ⑴荧光抗体的制备 ⑵免疫荧光测定方法 ⒉ 免疫酶抗体诊断试剂 ⑴免疫酶染色法用抗体诊断试剂 ⑵酶免疫测定用抗体诊断试剂 ①HBsAg酶标诊断试剂 ②HBeAg酶标诊断试剂 ③HAVAg（甲型肝炎病毒抗原） 酶标诊断试剂 ④测定HIV（人免疫缺陷病毒）抗 原的酶标抗体诊断试剂 ⑤甲胎蛋白（AFP）酶标抗体诊 断试剂 ⑥癌胚抗原（CEA）的酶标抗体 诊断试剂 ⒊ 放射免疫用抗体诊断试剂 放射免疫技术是将放射性核素分析的高度灵敏性与抗原抗体反应的特异性结合起来建立的检测技术。 放射性核素标记抗体的方法： ①氯胺-T法 ②Iodogen氏法 抗原的测定有： 　①夹心法 　②间接法 　③竟争法 常用标记抗体试剂有 ①HBsAg放射性核素标记抗体 诊断试剂 ②HBeAg放射性核素标记抗体 诊断试剂 ③HIV抗原放射性核素标记抗体 诊断试剂 ④AFP放射性核素标记抗体 诊断试剂 ⑤CEA放射性核素标记抗体 诊断试剂 三、导向诊断药物 放射性核素标记抗体 肿瘤放射免疫显像 放射免疫显像优点： ①在体内确切肿瘤定位作用，准确性达90%，灵敏度达100%。 ②在体内可检出0.5cm大小的病灶，并可检出肺、脑的转移灶。 ③小分子抗体易到达肿瘤部位， 可显著提高T/NT值。 ④抗体在肿瘤部位可保留6～9日 ⑤能观擦抗体在血中的半衰期和 可能出现的不良反应。 放射免疫显像定位技术 将抗肿瘤单克隆抗体（McAb）与二乙基三胺五乙酸（DTPA）在体外偶联成McAb-DTPA，再注入体内后，就能与体内组织相结合。3天后注入放射性核素In-113M（半衰期100m），因DTPA是重金属离子络合剂，所以In-113M可以结合到DTPA分