酸性磷酸酶的幻灯片.pptVIP

酸性磷酸酶的分离纯化和动力学分析 李 平 法 概 述 酶在物质代谢及调节中的重要意义； 常用的酶蛋白分离纯化方法； 酶类检测在临床生化检验中的意义； 酸性磷酸酶作用特性及动力学特点。 目 的 要 求 1. 巩固诊断酶学有关的理论与实验知识； 2. 掌握酶的分离纯化方法； 3. 掌握酸性磷酸酶（aicd phosphatase ACP）活性测定的原理、方法和影响因素； 4. 熟悉酶活性测定的条件选择和方法建立。 * * 临床生物化学教研室 试剂与器材 一、ACP的分离纯化试剂：见实验教材P31； 二、ACP动力学分析试剂：见实验教材P35； 三、器材：普通离心机，721分光光度计，恒温水浴箱，研钵等。 实 验 内 容 一、 ACP的分离纯化 二、 ACP的比活性分析 三、 ACP的动力学分析 1. 时间进程（t-V ）曲线 2. 酶浓度-速度（[E]-V）曲线 3. pH-酶活性 （pH-V）曲线 4.底物浓度-速度（[S]-V）曲线 5.抑制剂-速度（[I]-V）曲线 一、 ACP的分离纯化 1.概况： ACP分布广泛 分子量100kD 最适pH5.0 热稳定性较好 溶解度较高 临床应用广 2. ACP的分离纯化方法 ? 根据ACP的理化性质，可以用层析、电泳、透析等多种方法分离纯化。 ?本实验采用分级离心+分段盐析法： ACP与其它成分（细胞膜、杂蛋白）密度不同，以次逐步离心分离； ACP能溶解于水和低饱和度的硫酸铵溶液，在70oC仍保持稳定，以此进行杂蛋白的变性沉淀和分段盐析。 3.ACP分离纯化的步骤流程 小麦胚芽100g+200ml冷蒸馏水 滤 液 研碎，4层纱布过滤 3500rpm，10min离心 上清液 I 4000rpm，10min离心 1mol/L MnCl2 2ml/100ml上清液 I 上清液 II （激活并稳定ACP， 沉淀杂蛋白） 缓慢搅拌 4000rpm，8min离心 上清液 5000rpm，10min离心 饱和硫酸铵 54ml /100ml上清液 II 上清液 II （溶解ACP， 沉淀杂蛋白） 4000rpm，8min离心 上清液 III 70oC水浴2min 冷水浴3min 饱和硫酸铵 51ml /100ml上清液 II 沉淀（酶粗提物） （ 沉淀ACP） 缓慢搅拌 缓慢搅拌 4000rpm，10min离心 约1/3上清液 III蒸馏水，溶解，洗涤 （溶解ACP， 沉淀杂蛋白） 4000rpm，10min离心 上清液 IV 沉淀（酶粗提物） （ 沉淀ACP） EDTA9ml，饱和硫酸铵10ml /100ml上清液 IV，2倍体积预冷甲醇 沉 淀（酶纯化物） 4000rpm，10min离心 蒸馏水溶解，洗涤 上清液 V （酶液） 缓慢搅拌 1.各上清液中蛋白质含量测定 原理：染料结合比色法——CBBG-250，?max=595nm； 步骤：标准曲线制作 各上清液中总蛋白测定（做平行管，进 行重复实验，减少随机误差。 二、 ACP的比活性分析 2.各上清液中ACP活性测定 酚-4-AAP显色法:以磷酸苯二钠为底物，由ACP催化生成苯酚，在碱性条件下苯酚与4-AAP缩合最终生成红色醌类化合物，?max = 510 nm； 注意：显色过程中两种缓冲液： 柠檬酸缓冲液：pH5.0，提供ACP反应条件 碳酸盐缓冲液：pH10.0，提供成色反应条件 3.各上清液中ACP比活性分析 ACP活性单位定义：每分钟每毫升酶液产生1nmol酚即nmol/min·ml为1个活性单位； 纯化倍数= 各上清液中ACP的比活性 上清液I 中ACP的比活性 比活性= 酶活性 U/ml 蛋白质含量mg/ml 酶的回收率= 各上清液中ACP的活性? 总体积 上清液I中ACP的活性?总体积 还可以计算蛋白回收率，反映纯化效果，代表方法的特异性。 三、 ACP的动力学分析 1. 时间进程（t-A ）曲线 A