2细胞生物学方法学案.ppt

细胞培养的不同阶段 原代培养(primary culture) 传代培养(secondary culture) 细胞系(cell line） 细胞株(cell strain） 制备过程：1984年Nobel奖 B 淋巴细胞＋“不死的”小鼠骨髓瘤细胞 杂交细胞（杂交瘤） B淋巴细胞 (产生特异性抗体) 肿瘤细胞 (在体外无限增殖) 将每个杂交瘤细胞分别增殖，就得到很多单一细胞 的克隆，一个克隆可以产生一种特异性单克隆抗体 、 差速离心 (differential centrifugation) 将匀浆液置于离心管内，在密度均一的介 质中，经过一系列速度递增的离心后，可 将不同大小的颗粒分离 细胞器在差速离心中沉降顺序为： 细胞核 ? 线粒体 ? 溶酶体和过氧化物酶体 ? 内质网和高尔基复合体 ?核糖体 差速离心只能将大小有显著差异的成分分开，更精细的分离采用密度梯度离心 细胞组分的分析 第二章 细胞生物学研究方法 细胞生物学的概念 细胞生物学 (Cell Biology) 探讨细胞生命现象的发生规律及其本质的 科学 运用物理学和化学的技术成就以及分子生 物学的理论与方法，在不同的水平上 (显微、亚显微、分子) 分别或综合研究细胞的结构、功能和各种生命活动规律的科学 细胞生物学从细胞、亚细胞和分子水平来研究细胞的生命活动 细胞小而复杂，研究技术的有效性和局 限性决定了人们对细胞的认识 显微镜技术 (显微、亚显微结构与功能) 细胞的分离与培养 (研究材料生产保存) 细胞组分的分级分离 (细胞器和大分子) 分子生物学技术 细胞生物学研究方法 光学显微镜技术(optical microscopy) 显微结构的观察 ( ＞0.2 ?m) 普通光学显微镜 (light microscope) 分辨率为 0.2 ?m，动物细胞直径为10 ~ 20 ?m，人眼的分辨率为 100 ~ 200 ?m 显微镜观察的组织通常经过固定和切片 细胞的不同成分可通过细胞化学方法被选择性地染色，了解细胞化学组成及活性 细胞形态结构的观察 光源 聚光器 物镜 目镜 标本 反射棱镜 光学显微镜的结构与成像 相差显微镜 (phase contrast microscope) 利用光的衍射和干涉特性，把透过标本 不同密度区域光线的光程差 (相位差) 转变为振幅差 (明暗差) ，使细胞各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比 观察活细胞形态和活动，无须染色固定 细胞形态结构的观察 微分干涉相差显微镜 (differential interference contrast microscope, DIC) 又称 Nomarski 相差显微镜 将两束正交偏振的平行光 (相互垂直的两个偏振方向的光波) 通过观察物体后所产生的光程差转变为振幅差，从而表现为明暗形式的显微图像，能显示结构 的三维立体投影，其标本可略厚一点 活细胞结构观察、显微操作 细胞形态结构的观察 暗视野显微镜 (dark field microscope) 特殊的聚光器使得光线不能直接进入物镜，被标本反射和衍射的光线才可以进入物镜 在黑暗的背景中通过物体明亮的边缘，衬托出物体的形态及变化，但不能分辨其内部结构 观察无色透明标本如活细胞等 细胞形态结构的观察 在日常生活中，室内飞扬的微粒尘土是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束从光线从门缝斜射过来，灰尘便粒粒可见了，这是光学上的丁达尔现象 制造暗视野显微镜的灵感 细胞形态结构的观察 荧光显微镜 (fluorescence microscope) 对细胞的某些结构或分子进行荧光标记 以紫外线为光源，激发经过荧光染料染 色后能与荧光染料共价结合的某些细胞 成分产生荧光 (诱发荧光) 了解所标记的结构或分子在细胞中的存在、分布、定位、及其动态变化等 染色简便、敏感度高、图像彩色 细胞形态结构的观察 激光共聚焦扫描显微境 (laser confocal scanning microscope, LCSM) 配备激光光源、扫描装置、数字信号处理系统、图像输出设备 用激光作光源，对活细胞和组织或细胞切片逐点、逐行、逐面快速扫描，得到不同焦距平面的光学切片，整合为具有三维特征的立体空间图像 组织光学切片、细胞结构